2019 Fiscal Year Research-status Report
多剤耐性緑膿菌感染症に有効な多剤排出ポンプ阻害剤の創薬に向けた分子基盤の構築
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19K07547
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| Research Institution | Meiji Pharmaceutical University |
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Principal Investigator |
森田 雄二 明治薬科大学, 薬学部, 教授 (00454322)
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2019-04-01 – 2022-03-31
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| Keywords | 緑膿菌 / 薬剤耐性 / 多剤排出ポンプ阻害剤 / アミノグリコシド / ベルベリン |
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| Outline of Annual Research Achievements |
３成分型多剤排出ポンプMexXY-OprM のうち、基質認識の成分であるRNDファミリートランスポーターMexYの推定立体構造から基質であるアミノグリコシドと結合するアミノ酸残基を予想し、MexYの部位特異的変異導入体をいくつか構築した。薬剤感受性試験の結果から、導入体のうち、アミノグリコシド耐性や阻害剤であるベルベリン（誘導体）の阻害を軽減すると示唆されるものが得られた。ランダムにMexXY-OprM変異体を構築する系の確立を模索したが、今年度中に確立することはできなかった。MexXY－OprMの排出活性測定系を１つ確立した。ベルベリンは、核酸と結合することで蛍光を上昇させる性質があることから、緑膿菌の体内に蓄積したベルベリン量をマイクロプレートリーダーで測定することで、ベルベリンのMexXY-OprMによる排出活性を測定した。具体的には、４つのRND型多剤排出系を欠損し、MexXY-OprMを過剰産生した緑膿菌PAO1由来の変異株IMPU 14と、さらにmexXYを欠失した緑膿菌変異株IMPU 16のベルベリン蓄積量を比較した。アッセイ系に10倍程度のアミノグリコシドであるアミカシンを添加したが、MexXY-OprMのベルベリン排出活性にほとんど変化は観察されなかった。
ベルベリンからいくつかのベルベリン誘導体を構築した。薬剤感受性試験により、多剤耐性緑膿菌に対するMexXY-OprMによるアミノグリコシド耐性阻害作用を検討したところ、既報の13-(2-Methylbenzyl) Berberineだけでなく、13-(2-bromobenzyl) Berberineも阻害活性が増大していることが見出された。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
以下の3つの理由から、おおむね順調に進展していると判断した。１）構築したMexYの部位特異的変異導入体のうち、アミノグリコシド耐性やベルベリン（誘導体）の阻害を軽減するものが得られた。２）ベルベリンの排出活性測定系を構築した。３）13-(2-Methylbenzyl) Berberine以外にMexXY阻害活性がベルベリンより増大しているベルベリン誘導体13-(2-bromobenzyl) Berberineを見出した。
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| Strategy for Future Research Activity |
ランダムなMexXY-OprM変異体構築法を確立し、MexXY-OprM変異体を選択する。また今年度確立したベルベリン排出活性測定系は、簡便であるが、ベルベリン濃度の範囲が限定されること、ベルベリンの蛍光を阻害するものなどがあり、測定系に限界が見られたので、超高速液体クロマトグラフ‐タンデム質量分析（UHPLC-MS/MS）法による緑膿菌のアミカシン蓄積量の新しい測定系の開発を目指す。この方法では、アミカシンとベルベリンの同時定量も可能である。有機合成実験では、引き続きベルベリン13位への置換基に焦点を当てた構造展開研究を推進する。特に抗菌活性を持つ化合物にしばしば見出される2-アミノチアゾリル基の導入を検討したい。
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| Causes of Carryover |
物品費に関しては、既存の物品や他研究費で購入したものを使用することで実験を遂行することが可能であったため、予定より少ない額になった。またコロナ禍により学会参加や研究打合せができなかった。
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