免疫チェックポイント阻害剤を用いたH. suis感染胃リンパ腫抑制効果の検討

2019 Fiscal Year Research-status Report

• Project/Area Number: 19K07553
• Research Institution: Hokkaido University
• Principal Investigator: 山本 幸司 北海道大学, 大学病院, 特任助教 (70608322)
• Project Period (FY): 2019-04-01 – 2022-03-31
• Keywords: H. suis感染 / 胃MALTリンパ腫 / B細胞 / T細胞 / 免疫チェックポイント関連遺伝子

Outline of Annual Research Achievements

今年度計画予定であったH. suis感染胃MALTリンパ腫構成細胞上のPD-L1、ならびに、PD-1発現解析を以下の通り実施した。
H. suisを野生型マウスに経口感染させ、感染6か月後にマウス胃を摘出し、1 mMのジチオトレイトール、ならびに、1 mM EDTAで上皮組織を除去後、細胞培養液で1 mg/mlに調製したコラゲナーゼを用いて、37℃で3時間振盪・混和させた。その後、B細胞特異的抗体 (B220ならびにCD19)、T細胞特異的抗体 (CD4ならびにTCR)、樹状細胞特異的抗体(CD11cならびにMHCⅡ)、ならびに、濾胞樹状細胞特異的抗体 (FDC-M1)とPD-L1特異的抗体、または、PD-1特異的抗体を用いて多重染色を行い、フローサイトメトリーにてマウス胃粘膜に浸潤したB細胞、T細胞、樹状細胞、ならびに、濾胞樹状細胞上のPD-L1、ならびに、PD-1の発現解析を行った。結果、H. suis感染マウス胃粘膜に浸潤したB細胞上ではPD-L1が高く発現しており、H. suis感染マウス胃粘膜に浸潤した他の細胞上ではPD-L1の発現はほとんど認められなかった。また、同様な手法を用いて、H. suis感染マウス胃粘膜に浸潤した細胞上のPD-1発現細胞の解析を行ったところ、T細胞上においてPD-1の発現が認められ、胃粘膜に浸潤した他の細胞ではその発現はほとんど認められなかった。
これらのことから、H. suis感染後の胃粘膜に浸潤したPD-L1陽性細胞はB細胞であり、また、PD-1陽性細胞はT細胞であることが初めて明らかとなった。

Current Status of Research Progress

2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.

Reason

本年度計画予定であったH. suis感染胃MALTリンパ腫構成細胞上のPD-L1、ならびに、PD-1発現解析を実施し、当初の予想通りの結果を得ることが出来た。

Strategy for Future Research Activity

次年度計画予定である以下の項目について実施よていである。
1. 組換えIFN-γ刺激後のリンパ腫細胞上のPD-L1発現メカニズムの解析を実施する。具体的には、ヒトMALTリンパ腫細胞株を1×106個を培養皿にまき、コントロール群、組換えIFN-γ処理群 (1μg/ml)で24時間、ならびに、48時間で刺激実験を行い、細胞上のPD-L1遺伝子の発現を定量的PCR法、ならびに、フローサイトメトリーで評価する。
2. H. suis感染マウス胃粘膜に浸潤したT細胞内遺伝子の網羅的解析を実施する。
具体的には、非感染野生型マウス、ならびに、H. suis野生型感染マウスから胃を摘出し、1 mMのジチオトレイトール、ならびに、1 mM EDTAで上皮組織を除去後、細胞培養液で調製したコラゲナーゼを用いて、37℃で3時間振盪・混和させる。回収される細胞に対して、T細胞特異的抗体を用いて染色後、セルソーターにてマウス胃粘膜に浸潤したT細胞を精製する。精製後、細胞からRNA抽出を行い、T細胞シグナルに関与する遺伝子について網羅的に解析する。

Causes of Carryover

(理由)初年度に購入予定であった試薬が輸入扱いになり、今年度中に試薬の確保ができなかったため。

(使用計画)組換えIFN-γ刺激後のリンパ腫細胞上のPD-L1発現メカニズムの解析ならびにH. suis感染マウス胃粘膜に浸潤したT細胞内遺伝子の網羅的解析を行うための試薬ならびに解析費用代に使用する予定である。