2019 Fiscal Year Research-status Report
Analysis of survival strategy and pathogenic factors of bacteria using silk worm infection model
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19K07556
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| Research Institution | Yamaguchi University |
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Principal Investigator |
清水 隆 山口大学, 共同獣医学部, 准教授 (40320155)
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| Project Period (FY) |
2019-04-01 – 2022-03-31
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| Keywords | 野兎病菌 / Fransisera / tularemia / カイコ / ペプチドグリカン / mltA / slt |
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| Outline of Annual Research Achievements |
野兎病菌の節足動物内での増殖機構は全く解明されていない。野兎病菌 (Francisella tularensis) 亜種novicida (F. novicida)はカイコに感染後カイコ内で増殖しカイコを死亡させるため、この組み合わせを利用して野兎病菌の節足動物内増殖因子を同定した。F. novicidaのトランスポゾン変異株ライブラリーからカイコが死亡しない変異株をスクリーニングした。その結果、８個の遺伝子が節足動物内での増殖に必須であることが明らかとなった。その中で、これまでに病原因子としての報告がなかったmltA遺伝子に注目し、解析した。mltA欠損株はカイコ体内、カイコ由来細胞株BmN4細胞内での増殖が減弱していた。またmltA欠損株はヒトマクロファージ細胞株THP-１細胞においても増殖が減弱していた。このことからカイコとF. novicidaはヒト病原性因子の探索に利用できることが示唆された。現在投稿準備中である。
また、THP-1細胞における細胞傷害性を指標としたトランスポゾン変異株ライブラリーのスクリーニングにより、ヒト病原因子として新規にslt遺伝子を同定した。slt遺伝子は細胞内でオートファゴソームによる認識・分解から脱出するために必須であった。この結果はPLOS ONE誌に投稿し、掲載された。
野兎病菌感染に関与する宿主因子CRISPRを用いた遺伝子破壊株を利用して同定するために、HeLa細胞での野兎病菌感染方を確立した。F. novicidaに特異的な抗体をマウスで作出し、抗体を添加した菌体をFc受容体を発現したHeLa細胞に感染させたところ、細胞内増殖と細胞障害が観察された。引き続き宿主因子の同定を進めていく予定である。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
本研究では次の３項目について研究を行う予定である。A. カイコを用いた宿主内での定着・増殖に重要な因子の同定。B. カイコを用いた節足動物内媒介による病原性への影響の検討。C. 宿主内での増殖メカニズムの解明。
AについてはF. novicidaとカイコを用いた野兎病菌の節足動物内増殖モデルを構築し、そのモデルを利用し、mltA遺伝子が野兎病菌の節足動物内増殖因子であることを新規に同定した。現在論文を投稿準備中である。またヒト細胞株の細胞障害をモデルにしたシステムを構築し、細胞障害に必須の新規の病原因子を同定し、PLOS ONE誌に掲載された。
Bについては感染モデルの構築が今年度の研究で完了したため、引き続きカイコ感染における野兎病菌の質的な変化を検討していきたい。
CについてはCRISPRを用いた遺伝子破壊細胞を用いて、野兎病菌感染に重要な宿主側の因子を同定することを目的としている。これまでは遺伝子破壊を適用するHeLa細胞に野兎病菌を感染させることが不可能であったが、Fc受容体を発現させたHeLa細胞に特異抗体を添加した野兎病菌を感染させることで、HeLa細胞への感染が可能となった。このシステムを用い、宿主因子の同定を進めていきたい。
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| Strategy for Future Research Activity |
引き続き次の３項目について研究を行う予定である。A. カイコを用いた宿主内での定着・増殖に重要な因子の同定。B. カイコを用いた節足動物内媒介による病原性への影響の検討。C. 宿主内での増殖メカニズムの解明。
AについてはカイコとF. novicidaの組み合わせがヒト病原性モデルとしても使用できることが示唆されたため、さらなるスクリーニングを行い、新たな節足動物内増殖因子、ヒト病原性因子の同定を目指したい。
Bについてはカイコ感染F. novicidaからRNAを抽出し、RNA-Seq解析を行うことで節足動物内での野兎病菌の発現遺伝子を解析したい。また節足動物感染後の野兎病菌のマウスやヒト細胞株への感染性の違いを検討したい。
CについてはガイドRNAライブラリーを使用しCRISPRにより変異をいれたさHeLa細胞を構築し、野兎病菌感染により細胞が障害されない細胞を取得することにより野兎病感染に重要な宿主因子を同定したい。
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