2019 Fiscal Year Research-status Report
Study of pathogenic mechanisms of <i>Helicobacter cinaedi</i> focused on its tropism for macrophages.
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19K07559
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| Research Institution | University of Shizuoka |
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Principal Investigator |
三宅 正紀 静岡県立大学, 薬学部, 講師 (00295560)
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2019-04-01 – 2022-03-31
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| Keywords | Helicobacter cinaedi / マクロファージ / 細胞内生残性 / Ⅵ型分泌装置 |
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| Outline of Annual Research Achievements |
Helicobacter cinaedi (Hc) は微好気性グラム陰性らせん菌である。Hc感染時の症状として蜂窩織炎や菌血症が挙げられ、治療にはセフェム系、カルバペネム系などの抗生物質が用いられているが、症状寛解後に抗生物質の投与を止めると再燃することが臨床上問題となっている。一方、Hcがマクロファージ(MΦ)の泡沫化を誘導することにより、アテローム性動脈硬化症の促進因子となっていることが明らかとなっている。実際、Hc特異的外膜タンパク質抗体を用いた解離性大動脈瘤症例から得られた剖検組織の免疫組織染色では、粥状硬化巣のMΦの局在に一致した抗体陽性像が認められることが報告されている。我々は、これらの事実から、Hcの病態形成においてMΦ感染が重要なステップであり、本菌は何らかのMΦ内生残機構を有している可能性を推測している。本研究では、HcのMφ内生残性を検証すると共に、病原因子候補について変異株を作製し、本菌のMφ内生残性への寄与を検討した。ヒトMφ様細胞U937に感染したHc 野生株PAGU611は、感染24時間後までに、細胞内菌数が感染初期 (感染4時間後) の80分の1程度まで減少するが、その後再度細胞内菌数が上昇し、感染72時間後までに、感染24時間後の140倍程度まで増加した。これより、Mφ内におけるHcの生残性を確認した。また、Hcの病原因子候補としてⅥ型分泌装置に着目し、pGEM-Tベクターを利用した相同組換え法にて、Ⅵ型分泌装置構成因子Hcpのカナマイシン耐性遺伝子挿入変異株を構築することに成功した。本変異株のU937細胞内生残性を調べたところ、感染72時間後において細胞内に生残する菌が存在した一方、感染4、24時間における細胞内菌数は野生株より有意に少なかった。これより、Hcの能動的なMΦ侵入におけるHcpの関与が示唆された。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
Hcの細胞内生存・増殖性解析は、計画立案当初、本菌が寒天培地上にコロニーを形成できないとして、リアルタイムPCR法にて行う予定であったが、培養条件の改善 (水素存在下及び湿潤条件下) によりコロニー形成が可能であることが判明したため、菌感染細胞のライセートを寒天培地に接種して発育するコロニーを計数するコロニーカウント法を採用した。これより解析した感染細胞内菌数については、死菌を含まず生菌のみをカウントしたデータであることが担保された。
また、HcのⅥ型分泌装置構成因子Hcpの変異株を構築することに成功した。さらに、本Ⅵ型分泌装置の別な構成因子であるDotUの変異株についても得ることができたが、細胞内生存・増殖性の解析結果については現時点でバラツキがあるため、引き続き精査している。さらに、本菌napA遺伝子にコードされるCAIPが、動脈硬化症の原因となるMΦの泡沫化を誘導する活性を保有することが報告され、本因子がMΦ内生残性へ寄与している可能性があるため、変異株の作製に着手している。
感染U937細胞内で発現が変動するHc遺伝子のゲノムアレイを利用した網羅的探索については、感染細胞内のHcを収集することにおいて、菌をU937細胞に感染させた後、細胞外の菌を死滅させるために、ゲンタマイシン処理を行っても、その後継続的に一部の細胞内菌が細胞外に排出される、または排出された菌が細胞培養液中で増殖することが判明し、純粋に感染細胞内の菌のみを収集することができるかについて疑念が生じているため、現在手法についてあらためて検討している。
siRNAによりatg5をノックダウンしたU937細胞 (U937 atg5KD) の作製については、未だ実施に至っていないが、野生株のU937細胞感染におけるLC-3との共局在性に関する特異的抗体を利用した共焦点レーザー蛍光顕微鏡解析に着手している。
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| Strategy for Future Research Activity |
Hcの感染Mφ内における詳細な細胞内動態を解析する。感染Mφ内におけるHcの経時的な細胞内トラフィッキングについては、特にエンドサイトーシス経路あるいはオートファジー経路による殺菌システムとの関連に着目し、特異的抗体を用いた免疫蛍光染色法にて調べる。さらに、透過電子顕微鏡 (TEM) 解析にて、感染細胞内におけるHcの細胞内小器官との相互作用を含めた経時的な局在の様子を観察する。作製した病原因子候補の変異株についても同様な解析を行い、野生株の挙動と比較することにより、Hc特異的な細胞内動態への当該因子の関与について精査する。
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