2020 Fiscal Year Research-status Report

インフルエンザウイルスのゲノムに由来するsmall RNAの生成メカニズムと機能

Research Project

Project/Area Number	19K07576
Research Institution	Kyoto University
Principal Investigator	古瀬祐気京都大学, ウイルス・再生医科学研究所, 特定助教 (50740940)
Project Period (FY)	2019-04-01 – 2023-03-31
Keywords	インフルエンザ / ゲノム / 機能性RNA
Outline of Annual Research Achievements	インフルエンザの病態を理解するためには、インフルエンザウイルスの増殖機構や宿主細胞との相互作用を解明することが重要である。そのためには、ウイルスゲノム上にコードされるタンパク質だけではなくゲノム上の塩基配列に由来する機能性RNAの理解が必須である。これまでにわれわれは、インフルエンザウイルスがsmall RNAを産生することや、それがウイルスの生活環に影響を与えていることなどを示してきた。令和２年度の実績として、ウイルスに由来するRNAが化学的な修飾を受けることで機能が変化する可能性を検討した。培養細胞にインフルエンザウイルス株を感染させた後にRNAを抽出し、化学修飾を受けたRNAを検出する抗体を用いてRNA免疫沈降実験を行った。検討したRNA修飾は、Inosine, 5-methylcytosine, N6-methyladenosine, N1-methyladenosine, Pseudouridine, N4-acetylcytidine, 7-methylguanosineの7種類である。いずれのRNA免疫沈降実験においても、次世代シーケンサー解析を行うために十分な量のRNAを回収することができた。得られたRNA試料をもとにランダムプライマーによる逆転写反応を行い、その後に両末端へのアダプター配列付加とPCRによる増幅反応を行った。調整されたサンプルを次世代シーケンサー解析に供し、各サンプル当たり約6億リードの塩基配列が取得された。
Current Status of Research Progress	Current Status of Research Progress 2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned. Reason 前年度までに確立した実験系をもとに、化学修飾という新たな視点から機能性RNAについて検討するための細胞生物学的および生化学的実験を順調に遂行することができた。
Strategy for Future Research Activity	次世代シーケンサーによって得られたデータを解析することで、ウイルス由来RNAのどの部位が化学修飾を受けているのか同定する。さらに、その修飾を人工的に制御することでウイルスの増殖や病原性に変化が起こるのかを検討していく。
Causes of Carryover	今年度に生物学的実験のための試薬や消耗品を購入予定であったが、前年度までに購入した試薬や物品の残分で実験を遂行することができた。また、いくつかの実験は次年度以降に行うように計画を変更しために、次年度使用額が生じた。次年度使用額は、あらためて実験消耗品、受託解析、成果発表などに用いる予定である。