ウイルス複製タンパク質の構造解明と複製阻害薬剤の開発

2019 Fiscal Year Research-status Report

• Project/Area Number: 19K07582
• Research Institution: National Agriculture and Food Research Organization
• Principal Investigator: 加藤 悦子 国立研究開発法人農業・食品産業技術総合研究機構, 高度解析センター, 主席研究員 (00355752)
• Co-Investigator(Kenkyū-buntansha): 松村 浩由 立命館大学, 生命科学部, 教授 (30324809)
• Project Period (FY): 2019-04-01 – 2022-03-31
• Keywords: ウイルス / トマトモザイクウイルス / コロナウイルス / 複製蛋白質 / 立体構造

Outline of Annual Research Achievements

2020年5月現在、世界各地で新型コロナウイルス（SARS2）の蔓延が止まらない。ウイルスは人類にとっての脅威であり、このような状況が起こることを想定し本研究を立案し採択され、研究が開始されたした。本研究では、我々の生活を脅威に陥れるウイルスへの対抗策として、①ウイルスの複製機構の構造情報を基盤とした解明（ウイルスを知る）、②新規抗ウイルス薬候補の探索（ウイルス戦略の構築）、を目指して研究を進めている。今年度は①について、a:SARS2と酷似している豚コロナウイルス（PEDV）のヘリカーゼドメイン(Hel)について結晶構造解析に成功した。我々はすでにコロナウイルスとプラス鎖RNAウイルスのモデルとして研究されているトマトモザイクウイルス（ToMV）に対して、Helに相互作用しウイルスの複製を阻害する化合物を見出している（特許取得済み）。今後これら構造と阻害機構の詳細について解析を進める予定である。さらに、b:ToMVの複製蛋白質全長（プラス鎖RNAウイルスに共通に存在するHelとメチルトランスフェラーゼドメイン(Met)を含む）の精製を行い、構造解析を進めている。130K単体、130K/ATPγSおよび130K/ATPγS/SiRNA複合体について、X線溶液散乱およびクライオ電顕による検討を進めた。現在、130K/ATPγS/SiRNA複合体構造の精密化が進んでいる。この構造が解明できれば、プラス鎖RNAウイルスに共通に存在するメチルトランスフェラーゼドメインの構造が世界で初めて解明できることになる。また、HelとMetは複製に必須なドメインであり、両者の相互作用様式が解明できれば新たな創薬のターゲットを見出すことが期待できる。

Current Status of Research Progress

2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.

Reason

①ウイルスの複製機構の構造情報を基盤とした解明：今年度は、①-a:SARS2と酷似している豚コロナウイルス（PEDV）のヘリカーゼドメイン(Hel)についてZnを用いたSADにより位相を決定し結晶構造解析に成功した。PEDV－Helは、この構造決定直前に構造が報告されたSARSのHelの構造と酷似していた。①-b:ToMVの複製蛋白質（１３０K）全長の精製を行いX線溶液散乱およびクライオ電顕による観察を行った。130Kはウイルスの複製に必須なるHelとメチルトランスフェラーゼドメイン(Met)を含むとともに、RNAサイレンシングのターゲットとしても機能することが知られている。X線溶液散乱の結果、ToMVの130Kは、単体では不安定であるが、ATPγSの存在下で安定化することが分かった。クライオ電顕の観察においても、130K単体では良好な電顕像を得ることはできなかった。一方、130K/ATPγS複合体および130K/ATPγS/SiRNA複合体については良好な電顕像を得ることができた。130K/ ATPγS/SiRNAについて構造解析可能なデータが得られ、現在、構造の精密化を進めている。
②新規抗ウイルス薬候補の探索：我々はすでにコロナウイルスとプラス鎖RNAウイルスのモデルとして研究されているトマトモザイクウイルス（ToMV）に対して、Helに相互作用しウイルスの複製を阻害する化合物を見出している（特許取得済み）。しかし、その作用機構は明らかになっていない。そこで、ToMV-およびPEDV-Helと化合物との複合体構造解析に着手した。共結晶の創出にトライしているが現時点で、共結晶のデータは得られていない。
以上のように、②以外の研究は順調に進展している。

Strategy for Future Research Activity

①ウイルスの複製機構の構造情報を基盤とした解明：①-a:構造がすでに決定しているToMV-,PEDV-,SARS-Helについて、構造を比較するとともに、我々がすでに見出しているHelに相互作用しウイルスの複製を阻害する化合物（特許取得済み）との結合様式について詳細に検討する。これにより薬剤の選択性などの情報を蓄積する。①-b:ToMVの複製蛋白質（130K）全長とATPγS複合体についてクライオ電顕のデータを取得し、構造解析を進める。現在精密化が進んでいる130K/ATPγS/SiRNA複合体との比較を行う。これにより、RNAサイレンシングの分子機構が明らかになるとともに、これらの構造が解明できれば、プラス鎖RNAウイルスに共通に存在するメチルトランスフェラーゼドメイン(Met)の構造が世界で初めて解明できることになる。また、ヘリカーゼドメイン（Hel）とMetは複製に必須なドメインであり、両者の相互作用様式が解明できれば新たな創薬のターゲットを見出すことが期待できる。
②ToMV-およびPEDV-Helとすでに複製阻害活性が見いだされている化合物との複合体構造解析を続けて行う。

Causes of Carryover

今年度は主にコンピュータを使用する構造計算が予定よりも早く進みこの研究に集中したため、タンパク質精製にかかると予想していた人件費と消耗品を必要としなかった。そのため残額が生じた。次年度は、新たなタンパク質精製の必要があること、さらには研究データが蓄積してきたため、論文の投稿や研究打ち合わせの必要があり、これらに使用したいと考えている。