2020 Fiscal Year Research-status Report
Identification of novel host anti-HIV-1 factors using sea lower animals
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19K07593
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| Research Institution | Nagasaki University |
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Principal Investigator |
久保 嘉直 長崎大学, 熱帯医学研究所, 准教授 (30273527)
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| Project Period (FY) |
2019-04-01 – 2022-03-31
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| Keywords | レトロウイルス / GILT / クルマエビ |
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| Outline of Annual Research Achievements |
我々は以前に、ヒトgamma-interferon-inducible lysosomal thiolreductase (GILT)が、様々なウイルス・エンベロープ蛋白質のS-S結合を切断することにより、感染を抑制することを発見した。GILTのthiolreductase酵素活性中心の配列はCXXCであるが、C末端側のシステイン残機をセリンに置換すると（CXXS）、thiolreductase活性が消失することが知られている。しかし、カニや昆虫などの甲殻類動物のGILTは、酵素活性中心の配列が元々CXXSとなっていることが報告された。前年度、我々は、RT-PCRによりクルマエビからGILT cDNAを単離し、クルマエビGILTも酵素活性中心がCXXSであるが、ヒト細胞にクルマエビGILTを発現させた時、マウス白血病ウイルス感染が抑制されることを突き止めた。今年度は、酵素活性中心をCXXSに置換したヒトGILT変異体(GILT C75S)を構築し、その感染に及ぼす影響を解析した。GILT C75Sを発現する細胞においても、野生型GILTを発現する細胞と同様に、マウス白血病ウイルス感染が抑制された。次にクルマエビGILTがthiolreductase活性を持っているかどうか解析した。以前我々は、野生型ヒトGILTを発現する細胞において、宿主因子CD63のS-S結合が切断されることを報告した。本研究で、クルマエビGILTを発現させた細胞では、CD63のS-S結合は、切断されなかった。この結果は、クルマエビGILTがthiolreductase活性を持っていないことを示唆する。本研究により、GILTの抗ウイルス活性には、thiolreductase活性を必要としないこと、GILTの本来の生物学的機能は抗ウイルスであることが分かった。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
クルマエビGILTはthiolreductase活性を持っていないが、抗ウイルス活性を持っており、thiolreductase活性が抗ウイルス活性に必須でないことを突き止めた。論文に投稿した時、観察されたGILTの抗ウイルス活性は、thiolreductase活性の著しい増加によるアーティファクトである可能性を指摘された。しかし、thiolreductase活性のないGILT変異体やクルマエビGILTも抗ウイルス活性を持っていたので、抗ウイルス活性がGILTの本来の生物学的な機能であることを示す重要な成果である。前年度に発見したHIV増殖を抑制するクルマエビ因子legmainの研究は進展していないが、当初計画よりも重要な成果が得られたので、クルマエビGILTの研究に焦点を絞り、期待以上の成果を得ることができた。
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| Strategy for Future Research Activity |
thiolreductase活性のないヒトGILT C75S変異体やクルマエビGILTが抗ウイルス活性を持っていたが、これらの蛋白質はどのようにしてウイルス感染を抑制するのであろうか。thiolreductase酵素活性中心がCXXSとなったGILTは、S-S結合を介して基質と複合体を形成することが報告されている。そこで、ヒトGILT C75S変異体やクルマエビGILT がウイルス・エンベロープ蛋白質と複合体を形成するかどうか解析する。GILTを発現する細胞にマウス白血病ウイルスを摂取し、５時間後にcell lysateを単離する。抗GILT抗体により免疫沈降し、その沈降物においてマウス白血病ウイルス・エンベロープ蛋白質が存在するかどうかウエスタンにより解析する。
legmainはヒト相同体が存在するのでヒトlegmain cDNAを単離する。shRNAによりlegmain発現をノックダウンした細胞を構築する。ノックダウンした細胞におけるHIV増殖効率を測定する。legmainをノックダウンした細胞ではHIV増殖を増加したなら、legmainはHIV増殖を抑制する新規宿主防御因子と結論づけることができる。
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| Causes of Carryover |
新型コロナウイルスの流行により、学会総会がzoomによって行われることになった。そのため旅費がかからなかった。次年度の学会もzoomによって行われる予定である。当初、予定していなかった、GILT C75S変異体やエビGILTとマウス白血病ウイルス・エンベロープ蛋白質の結合を免疫沈降法を行う。よって、抗マウスIgG抗体免疫沈降キット、抗ゴートIgG抗体免疫沈降キットを追加して購入する。
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