2019 Fiscal Year Research-status Report

Role of TLR9 in the pathogenesis of ANCA-associated vasculitis

Research Project

Project/Area Number	19K07602
Research Institution	Chiba University
Principal Investigator	古田俊介千葉大学, 医学部附属病院, 特任講師 (10422221)
Co-Investigator(Kenkyū-buntansha)	中島裕史千葉大学, 大学院医学研究院, 教授 (00322024)
Project Period (FY)	2019-04-01 – 2022-03-31
Keywords	ANCA関連血管炎 / TLR9
Outline of Annual Research Achievements	近年、ANCA関連血管炎(AAV)の病態形成におけるB細胞の重要性が示唆され、その後の複数の臨床試験によりB細胞を標的とした治療がAAVに有効であることが証明された。本申請研究では、propylthiouracil(PTU)/phorbol myristate acetate(PMA)-treated NETs-induced AAV(PTU-NETs AAV)、及びanti-MPO-IgG-induced AVV (anti-MPO AAV)をマウスに誘導し、B細胞におけるToll like receptor 9(TLR9)やその下流分子であるNuclear factor kappa B (NF-kB)などの、AAV発症における役割を明らかにすることを目的としている。これまでマウス好中球を用いてPMA誘導性のnetosisを解析している。マウスの腹腔にカゼインを注射した後、腹腔内洗浄液を回収したところ90%以上の好中球採取に成功している。採取されたマウス好中球を200ng/mL PMAを用いて刺激し、ギムザ染色によりnetosisを評価したところ、60%程度の好中球においてnetosisが誘導された。次に本申請研究者は、FACS解析によりnetosisの程度を定量評価する方法をセットアップ中である。方法としては抗シトルリン化ヒストンH2抗体を用いてnetosisを起こした好中球を描出していく予定である。以上のようにギムザ染色と抗シトルリン化ヒストンH2抗体を用いたFACS解析によりnetosisを高頻度に誘導するPMAの至適濃度を決定する予定である。
Current Status of Research Progress	Current Status of Research Progress 2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned. Reason 本実験計画では、propylthiouracil(PTU)/phorbol myristate acetate(PMA)-treated NETs-induced AAV(PTU-NETs AAV)、及びanti-MPO-IgG-induced AVV (anti-MPO AAV)をマウスに誘導し、B細胞におけるToll like receptor 9(TLR9)やその下流分子であるNuclear factor kappa B (NF-kB)などの、AAV発症における役割を明らかにすることを目的としているが、現在までマウス好中球に 200ng/mL PMAを添加することにより、netosisが誘導できることを確認済みである。次に本研究者はギムザ染色と抗シトルリン化ヒストンH2抗体を用いたFACS解析によりnetosisの程度を定量評価し、高頻度にnetosisを誘導するPMAの至適濃度を決定する予定である。PMAの至適濃度が決定したら、PMAによりnetosisを来した好中球をアジュバントとともにマウスに注射し、ANCA関連血管炎(AAV)様の病態をマウスに惹起させる予定である。
Strategy for Future Research Activity	これまでマウス好中球の分離とphorbol myristate acetate(PMA)刺激によるnetosisの誘導に成功している。今後は、ギムザ染色と抗シトルリン化ヒストンH2抗体を用いたFACS解析によりnetosisの程度を定量評価し、高頻度にnetosisを誘導するPMAの至適濃度を決定する予定し、PMAの至適濃度が決定後、PMAによりnetosisを来した好中球をアジュバントとともにマウスに注射し、ANCA関連血管炎(AAV)様の病態をマウスに惹起させる予定である。
Causes of Carryover	必要な試薬、マウス等の一部を研究室の他プロジェクトとの共用として購入できたため、次年度使用額が生じた。今年度は研究室内の他プロジェクトとの共有部分は少なくなるものと予想される。また、netosisを誘導する至適条件を得るために条件を振って実験をする必要が生じ、そのために次年度使用額分を使用したい。