2020 Fiscal Year Research-status Report
iNKT細胞消失マウスの発見に基づくiNKT細胞分化の新規分子機構の解析
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19K07624
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| Research Institution | Osaka University |
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Principal Investigator |
石川 絵里 大阪大学, 微生物病研究所, 助教 (20546478)
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2019-04-01 – 2022-03-31
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| Keywords | iNKT細胞分化 / セリンスレオニンキナーゼ / TCRシグナル |
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| Outline of Annual Research Achievements |
インバリアントナチュラルキラーT (iNKT) 細胞はT細胞とNK細胞の特徴を併せ持つ亜集団で、抗原として糖脂質を認識して速やかに活性化し、病原体や腫瘍の排除に寄与する。分化には転写因子PLZFの発現が重要であることが知られているが、胸腺におけるiNKT細胞分化を司るシグナルの全貌はまだ明らかになっていない。我々は以前、胸腺未熟T細胞をT細胞受容体刺激すると活性化するプロテインキナーゼD (PKD)のT細胞特異的PKD欠損マウスを樹立したところ、iNKT細胞のみが消失することを見出した。そこで大規模リン酸化プロテオミクスにより、iNKT細胞におけるPKDの基質を探索したところ、転写因子を含むいくつかの候補分子が挙がってきた。この独自の知見に基づき、細胞膜受容体から核に至るiNKT細胞分化誘導の分子機構を明らかにすることを本研究の目的とした。
今年度はまず、マウスから採取したiNKT細胞においてもTCR刺激によりPKDの活性化が認められるかを、胸腺iNKT細胞を用いて確かめた。また、PKD欠損マウスでiNKT細胞が消失するメカニズムを探索するため、胸腺選択を受ける直前の胸腺細胞を採取し、TCRおよびSALM抗体で刺激し、遺伝子発現の変動を観察した。PKD欠損細胞ではSALM共刺激によるPLZFの発現増強が減弱していたことから、PKD欠損マウスにPLZF Tgを導入し、iNKT細胞が認められるようになるかを検討した。
さらに昨年度、in vitro kinase assayにより、上記の大規模リン酸化プロテオミクスで見出されたいくつかの候補分子がPKDの直接の基質であることを明らかにしたが、これらのリン酸化フォームのマススペクトル解析を行い、リン酸化部位を同定した。また、このリン酸化部位をアラニンに置換したリン酸化不能型変異体ノックインマウスが得られたので、解析を行なった。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
今年度は、T細胞特異的PKD欠損マウスでiNKT細胞が消失するメカニズムを探索するため、iNKT細胞分化を模し、胸腺選択を受ける直前の胸腺細胞をTCRとSLAM抗体で共刺激し、野生型とPKD欠損細胞の遺伝子発現を比較した。iNKT細胞分化に必須の転写因子PLZFの発現は、野生型細胞ではTCR刺激のみに比べTCRとSLAMの共刺激により増強されたが、PKD欠損細胞ではこの発現増強が見られなくなった。さらに、T細胞特異的PKD欠損マウスにPLZF Tgを導入すると、iNKT細胞が野生型の半分程度に戻ることが判明した。これらの結果から、PKDはTCRおよびSLAMの下流でPLZFの発現誘導に働くことが強く示唆され、PKD欠損マウスにおけるiNKT細胞消失のメカニズムの一端を明らかにできたと考えられる。
大規模リン酸化プロテオミクスにより挙がってきたiNKT細胞におけるPKDの基質候補分子のいくつかについては、昨年度にin vitro kinase assayによりPKDの直接の基質となり得ることを明らかにした。これらのリン酸化フォームのマススペクトル解析を行なったところ、リン酸化プロテオミクス解析で検出された部位と同じ部位がリン酸化されていることが確認できた。また、これらの分子のPKDによりリン酸化されるセリンをアラニンに置換したリン酸化不能型変異体ノックインマウスが樹立できたため、解析を行なった。このうち一分子の変異体ノックインマウスでは、iNKT細胞の割合が野生型の半分程度となる知見が得られており、PKD下流でiNKT細胞分化へと繋がる基質分子である可能性が高い。以上の結果から、研究は概ね順調に進んでいると考えている。
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| Strategy for Future Research Activity |
PKD基質分子のリン酸化不能型変異体ノックインマウスが樹立できたため、これらのマウスをより詳細に解析し、iNKT 細胞の割合だけでなく、分化成熟段階やNKT1、NKT2、NKT17の割合についても変化があるか否かを観察する。変異体ノックインマウスでiNKT細胞の割合の低下が認められた基質分子については、実際に生体内のiNKT細胞においてもPKD依存的なリン酸化が起きているかを検証する必要があると考えている。また、PKDによるリン酸化が基質分子にどのような機能変化をもたらすかを明らかにするため、リン酸化によって制御される相互作用分子の大規模同定を試みる予定である。これにより、PKDが寄与するiNKT細胞分化の分子機構の詳細を明らかにしたいと考えている。
大規模リン酸化プロテオミクスで挙がってきた、上記の基質分子以外の他の多数のPKD基質候補分子についてもクローニングと解析を進めており、新たな基質とその機能を見出しつつある。
末梢iNKT細胞におけるPKDの機能解析については、本研究室で樹立した末梢T細胞特異的Cre発現マウスを用いたPKD欠損マウスが樹立でき、胸腺および末梢にiNKT細胞が存在することを確認している。今後は、末梢に存在するiNKT細胞でPKDが欠損していることを確認した上で、末梢iNKT 細胞の成熟や分布、機能について解析を行い、iNKT細胞の胸腺分化と末梢での維持・活性化におけるTCRシグナル経路に違いがあるか否かを明らかにしたいと考えている。
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| Causes of Carryover |
昨年度に作製を進めていたマウスが順調に樹立でき、当該年度はマウス樹立・維持経費が予想よりかからなかったため、差額が生じた。
差額分は、樹立したマウスの細胞解析や、PKD相互作用分子の大規模同定のためのマススペクトル解析に使用する予定である。
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