2019 Fiscal Year Research-status Report
悪性脳腫瘍とマイクログリアが織りなす微小環境におけるP5の機能的役割に関する研究
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19K07638
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| Research Institution | Kyoto University |
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Principal Investigator |
堀部 智久 京都大学, 医学研究科, 特定准教授 (20467468)
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| Project Period (FY) |
2019-04-01 – 2022-03-31
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| Keywords | 癌 / 分子シャペロン / 発光イメージング |
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| Outline of Annual Research Achievements |
本研究では、近年その機能的役割に関して注目されているマイクログリア細胞において、悪性脳腫瘍であるグリオブラストーマ（GBM）細胞とマイクログリア細胞との相互作用に基づくがん微小環境中における、プロテインジスルフィドイソメラーゼ（PDI）関連タンパク質の一つであるP5の機能的役割の解明を行い、GBMの微小環境中においてP5を標的とすることの有用性および新たな抗癌標的療法の可能性を提示することを目的としている。
平成31、令和元年度は、主に下記の研究内容を行った。
（1）マイクログリア細胞からのサイトカイン産生におけるP5の機能的役割; GBM細胞から精製した細胞外ベシクル（EVs）をヒトマイクログリア細胞株（HMC3）に添加することでサイトカインIL-6の産生が増加することをELISAで確認した後、siRNAによるHMC3細胞におけるP5のノックダウンを行い、IL-6の産生量増加への影響を調べた。
（2）P5ノックダウンによるマイクログリア細胞への影響; siRNAによるHMC3細胞におけるP5のノックダウンを行った後、HMC3の細胞増殖への影響を調べた。また、悪性脳腫瘍細胞から精製したEVs存在下でも同様の系でその影響を確認した。
（3）IL-6レポーターアッセイ用ベクターの構築; 生物発光を用いた検出を行うために、IL-6プロモーター領域をホタルルシフェラーゼ（fLuc）と組み合わせたレポーターベクターを構築し、LPSおよびEVs刺激により誘導されることを確認した。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
平成31、令和元年度に予定していたsiRNAによるP5のノックダウンによるマイクログリアからのサイトカイン産生への影響を確認でき、概ね良好な結果を取得することができ、次年度に予定している発光イメージング解析に必要な各種レポーターの構築も進んでいるため、ここまで概ね順調に進行していると思われる。
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| Strategy for Future Research Activity |
生物発光を用いた一細胞レベルでの発光イメージング解析手法を用いて、P5の人為的制御時におけるサイトカインプロモーターへの影響などをGBMから精製されたEVs存在下、あるいは、GBMとの共培養下において検討する予定である。
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| Causes of Carryover |
理由; 平成31、令和元年度に予定していたsiRNA、ELISA、ベクター構築のための各種キット類など必要な実験試薬等消耗品が、当初の想定よりもおさえることができたため。
使用計画; 令和2年度の研究費の使用としては、主に次の項目で使用予定である。
生物発光を用いた一細胞レベルでの発光イメージング手法に必要な試薬類および、消耗品、レポーターベクター構築のための各種キット類、ゼブラフィッシュなど小型魚類飼育のための保守費用（飼育設備含む）、細胞培養関連および、維持管理に必要な消耗品（プラスチック類など）。その他、学会発表のための費用（旅費など）を予定している。
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