病因性ミトコンドリアDNA変異によるがん転移促進機序の解析

2020 Fiscal Year Research-status Report

• Project/Area Number: 19K07654
• Research Institution: Chiba Cancer Center (Research Institute)
• Principal Investigator: 竹永 啓三 千葉県がんセンター(研究所), がん遺伝創薬研究室, 特任研究員 (80260256)
• Co-Investigator(Kenkyū-buntansha): 越川 信子 千葉県がんセンター(研究所), がん遺伝創薬研究室, 主任上席研究員 (90260249)
• Project Period (FY): 2019-04-01 – 2022-03-31
• Keywords: ミトコンドリア / ミトコンドリアDNA / 細胞外小胞 / 腫瘍内微小環境 / 転移

Outline of Annual Research Achievements

前年度に、マウス肺がん由来高転移性A11細胞が有する転移促進性G13997A変異ミトコンドリアDNA(mtDNA)が野生型mtDNAを有する低転移性がん細胞へ細胞外小胞（EV）を介して移行している可能性を示した。今回、MitoTracker Deep Redで標識したA11細胞とマクロファージ細胞株RAW264.7、癌関連線維芽細胞株WA-mFib (α-SMA陽性)あるいは細胞障害性T細胞株CTLL-2と共培養したところ、A11細胞ミトコンドリアの蛍光色がそれぞれの細胞内で観察された。そこで、腫瘍微小環境内でもがん細胞間およびがん細胞―間質細胞間でミトコンドリアの移行が起きるかどうかを検討するために、EGFP発現P29細胞皮下腫瘍中にMitoTracker Deep Red標識A11細胞を移植し、3日後に腫瘍切片を共焦点レーザー顕微鏡で観察したところ、EGFP陽性細胞中に赤色蛍光が観察された。また、P29細胞皮下腫瘍に蛍光染色A11細胞を移植し、切片をα-SMA抗体で緑色免疫蛍光染色を行ったところ、α-SMA陽性細胞中に赤色蛍光が観察された。従って、腫瘍内においてもミトコンドリアの移行が起きている可能性が示された。一方、A11細胞EVをMitoTracker Redで染色したところ、ある画分のEVが赤色蛍光を発し、それがAntimycin A処理により消失することが判り、EV画分中に電位差のあるミトコンドリア膜系が存在する可能性が示唆された。一方、前年度に、変異mtDNAを含有するEVを、mtDNA-lessのrho0細胞に添加したところ、変異mtDNAが細胞内に移入され短期間保持さることが示したが、実験方法の改良の結果、EV処理後２ヶ月間ほど細胞内に変異mtDNAが検出されることが判った。しかし、劇的にコピー数が増加するような現象は観察されなかった。

Current Status of Research Progress

4: Progress in research has been delayed.

Reason

研究目的としてG13997A変異を導入した低転移性細胞の転移能の変化を検討することになっているが、mtDNA-less細胞中および野生型mtDNAを有する細胞へ移入した変異mtDNAの安定的な維持とコピー数の増加がまだ達成されていないため検討ができていない。また、もう一つの研究目的として、G3394CあるいはC3497T SNPsががん細胞の転移能に及ぼす影響を検討することを上げているが、これらのSNPsを有する細胞材料が未だ見つかっておらず、研究が進捗していない。

Strategy for Future Research Activity

EV画分中にMitoTracker Redを取り込むものがあることが示唆されたが、極小のミトコンドリア自体が存在しているのか、EV内に極小ミトコンドリア断片が入っているのか判断がつかないので、現在、通常電子顕微鏡およびクライオ電子顕微鏡を用いて、調製EV中のミトコンドリア膜系の存在を検証する予定である。また、移入変異mtDNAの安定的な維持とコピー数の増加を達成するための方法論の検討をする必要がある。EV の取り込みと脱カーゴを促進するEV-Entry Reagentやミトコンドリ活性化物質等の効果を検討する予定である。

Causes of Carryover

論文の掲載料に当てたいので残しておいた。