2020 Fiscal Year Research-status Report
大腸がんにおけるヒト内在性レトロウイルスの発現解析と機能解明
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19K07666
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| Research Institution | Kobe University |
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Principal Investigator |
青井 三千代 (小柳) 神戸大学, 医学部附属病院, 特命助教 (90432327)
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| Co-Investigator(Kenkyū-buntansha) |
中川 草 東海大学, 医学部, 講師 (70510014)
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| Project Period (FY) |
2019-04-01 – 2023-03-31
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| Keywords | ヒト内在性レトロウイルス / 大腸がん / Nanoporeシークエンス |
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| Outline of Annual Research Achievements |
本研究の目的は、(1)大腸がんにおいて高発現しているヒト内在性レトロウイルス領域を長鎖シークエンスによって同定し、(2)同定した領域を大腸がん細胞株あるいは人工大腸がん幹細胞、大腸がんオルガノイドでノックダウンあるいは強制発現させることで、細胞の機能に影響を与える領域を見出し、(3)がんにおけるヒト内在性レトロウイルスの新しい機能を解明することである。
研究2年目であった昨年度は、初年度に解析を終了した2検体(がん部1検体、非がん部1検体）に加えて残りの3検体（がん部2検体、非がん部1検体）についても長鎖、短鎖シークエンスの解析を行った。また、これらの解析結果から同定した、大腸がんにおいて高発現するヒト内在性レトロウイルス領域のうちの3領域に着目して実験を進めた。
まず、大腸がん臨床検体のがん部由来のcDNAから発現領域のクローニングを行い、全配列を確認して転写物を同定した。また、その配列を元にタンパク質に翻訳される可能性のあるORFを含む領域をpickupして発現ベクターにクローニングし、大腸がん細胞株に導入して、タンパク質への翻訳の有無をウエスタンブロットを用いて検討した。また、タンパク質に翻訳されるORFについては細胞内での局在を免疫染色で確認した。
また、それらのORFに対するポリクローナル抗体を作成し、同じくウエスタンブロット、免疫染色にて確認をおこなったが、今のところ目的のタンパク質をdetetする良好な抗体は得られていない。
研究最終年度では、抗体作製を引き続き行い、タンパク質に翻訳されるORFを含む発現ベクターを強制発現した場合の細胞の増殖、形態の変化等、細胞に与える影響を観察し、機能を解析する予定である。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
当初の予定通り、初年度に解析を終了した2検体に加えて残りの3検体（がん部2検体、非がん部1検体）についても長鎖、短鎖シークエンスの解析を行うことができた。また初年度に同定した大腸がん部で高発現する領域の強制発現実験を行うことができたことから、研究は進展していると考えられる。
一方で、タンパク質に翻訳されるORFに対する抗体については良好な抗体が得られていないため、この点については予想通りに進展していないといえる。
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| Strategy for Future Research Activity |
研究最終年度では、ヒト内在性レトロウイルス領域に含まれるタンパク質に翻訳されるORFをdetectできるような良好な抗体を少なくとも1つ得ることを目指す。
また、ヒト内在性レトロウイルス領域に含まれるタンパク質に翻訳されるORFの発現ベクターを強制発現した場合の細胞の増殖、形態の変化等、細胞に与える影響を観察し、これらの持つ機能を解析する予定である。
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| Causes of Carryover |
新型コロナウイルスの流行により、2020年4月と5月の2か月間は研究を予定通り進めることができなかったため。
来年度速やかに実行する。
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