肺癌においてmiR-20aが制御する新規lncRNA、TILRの機能解析

2019 Fiscal Year Research-status Report

• Project/Area Number: 19K07679
• Research Institution: Aichi Cancer Center Research Institute
• Principal Investigator: 梶野 泰祐 愛知県がんセンター(研究所), 分子診断TR分野, 主任研究員 (50723673)
• Project Period (FY): 2019-04-01 – 2022-03-31
• Keywords: lncRNA / TP53 / miR-20a

Outline of Annual Research Achievements

我々はこれまでに、肺がんにおいてしばし遺伝子増幅を伴って過剰発現するmiR-17-92クラスターを同定し、その標的遺伝子および肺がんにおける重要性について示してきた。その一方でmiR-17-92クラスターによる肺がんの制御機構は複雑性に富んでおり、その標的遺伝子の同定と制御機構の解明の必要性が指摘されていた。我々はmiR-17-92クラスターの中でも、高発現且つ中心的な役割を担っているmiR-20aに着目し、miR-20aによって発現制御されるlncRNAの網羅的な探索を行った。その結果、機能未知の新規lncRNAを同定し、その作用機序よりTP53-inhibiting lncRNA、TILRと命名した。このTILRは、p53野生型肺がん細胞の生存を維持する重要なlncRNAであり、p53の発現制御を介して細胞死を抑制することを明らかにしていたので、本年度はTILRがどのようにしてp53を制御するのかその分子機構の検討を開始した。まず、TILRの5’-RACEおよび3’-RACEを行い、TILRの全長をクローニングし、in vitroにてビオチンラベル及びBrUラベルしたTILRを精製した。その後、細胞抽出液を用いてTILRをプルダウンし、miR-20aがTILRと結合することを明らかにした。次に、bufferや用いる細胞と細胞内画分抽出方法、さらにはTILRのラベル化の条件検討を行い、TILR結合タンパク質を同定するプルダウンアッセイを構築した。
また、TILRはp53の発現を制御して細胞死を抑制すると考えられるため、p53欠損肺がん細胞株を用いてTILRの機能を分子生物学的手法によって検討した。その結果、p53欠損肺がん細胞株ではTILRをノックダウンしてもp53標的遺伝子であるp21の発現は誘導されず、TILRはp53依存的にp21の発現を誘導することを明らかにした。

Current Status of Research Progress

2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.

Reason

肺癌において重要な働きをするmiR-20aの標的lncRNA、TILRの機能解析は、TILR結合タンパク質の網羅的な探索および分子生物学的手法によるTILRの重要性の検討を通じて順調に進行している。miR-20aの標的遺伝子として同定したTILRのクローニングを行い、in vitroプルダウン法によってTILRとmiR-20aの結合を明らかにした。さらに結合タンパク質の探索に向けて、細胞株やbufferなどの最適化を行い、網羅的な探索のためのプルダウンアッセイを構築した。さらに、p53欠損肺癌細胞株を用いて分子生物学的に検討することにより、TILRによるp21やMDM2の発現誘導はp53依存的であることを明らかにした。

Strategy for Future Research Activity

これまでに我々が肺癌において重要な働きをするlncRNAとして同定した機能未知の新規lncRNA、TILRの機能解明に向けて、網羅的な結合タンパク質および結合RNAの同定のためのアッセイ系の構築はほぼ完了した。今後は、様々な細胞株や細胞質および核画分を用いて、TILR結合タンパク質と結合RNAの探索を行う。さらに分子生物学的手法を用いた解析から、p21などの細胞周期や細胞死関連遺伝子の発現がp53に依存することを明らかにしたが、p53の修飾やp53タンパク質およびp53 mRNAの安定性や局在などの検討を通じ、TILRによるp53の制御作用点の検討を行う。

Causes of Carryover

当初の予定より研究計画は３年に跨っており、初年度に立ち上げることに成功したTILR結合タンパク質および結合RNAの同定手法を用いて、次年度より網羅的な探索を行う予定である。そのため、RNAプルダウンアッセイに必要な試薬と、結合タンパク質および結合RNAを同定するためのマススペクトロメトリー関連試薬およびRNAseq関連試薬などの次年度使用額が生じた。