2021 Fiscal Year Research-status Report

TCTP-EF1A2による翻訳制御を標的としたNF1腫瘍化機構の解析と治療法開発

Research Project

Project/Area Number	19K07691
Research Institution	Niigata University
Principal Investigator	小林大樹新潟大学, 医歯学系, 助教 (20448517)
Co-Investigator(Kenkyū-buntansha)	荒木令江熊本大学, 大学院生命科学研究部(医), 准教授 (80253722)
Project Period (FY)	2019-04-01 – 2023-03-31
Keywords	NF1 / TCTP / EF1A2 / 悪性腫瘍 / クロスリンク質量分析 / 翻訳制御
Outline of Annual Research Achievements	神経線維腫症Ⅰ型（NF1）は3000人に1人の割合で発症する遺伝性疾患で、悪性神経鞘腫瘍（MPNST）やグリオーマを発症することが知られている。本研究グループの以前の研究結果から、NF1腫瘍細胞内ではTranslationally Controlled Tumor Protein (TCTP)の発現が上昇しており、悪性度の高いNF1腫瘍ではTCTPの発現量が高くなる傾向にあることを明らかにした。加えて、TCTPはEF1A2を中心としたNF1腫瘍特異的な翻訳伸長因子群との相互作用によって、NF1腫瘍の悪性化に寄与することを明らかにした。本研究では、TCTP、およびEF1A2と相互作用するタンパク質との相互作用部位をクロスリンク質量分析法によって特定し、TCTP-EF1A2複合体の構造と機能を詳細に解析することで、TCTPのNF1腫瘍治療ターゲットとしての有用性を検討した。その結果TCTPのEF1A2への結合部位は、EF1A2とEF1A2の活性化因子であるEF1B, EF1D, EF1G複合体との結合部位の近傍であることが明らかとなった。したがって、EF1A2のGTP結合領域で翻訳伸長因子群との複合体の形成を媒介することによって、TCTPはEF1A2の活性化に寄与することが示唆された。また、TCTPはEF1A2のホモ二量体構造を形成する部位との拮抗的な結合を介してEF1A2の二量体化を阻害することで、EF1A2の翻訳機能を活性化することが考えられた。これらの情報をもとに、TCTPとNF1腫瘍特異的な翻訳伸長因子群の立体構造形成を阻害するような薬剤を選択的に用いることで、NF1に関連する腫瘍の治療の開発に応用できることが期待される。
Current Status of Research Progress	Current Status of Research Progress 3: Progress in research has been slightly delayed. Reason TCTPとEF1A2の相互作用部位をクロスリンキング質量分析法により同定することに成功し、これらのデータに関しては論文投稿の準備段階にある。一方で質量分析による翻訳活性測定法の構築にあたり、必要な物品調達、質量分析装置の故障対応等でCOVID-19感染拡大による影響を受け、TCTP-EF1A2複合体を介した蛋白質の翻訳制御によって活性化されるシグナルネットワーク解析が遅れている状況である。
Strategy for Future Research Activity	１.TCTP-EF1A2によって翻訳が活性化される分子群の網羅的な同定新規NF1腫瘍促進シグナルネットワークを抽出し (in silico 解析)、シグナル活性化メカニズムを解析する。TCTP/EF1A2を発現抑制および過剰発現したがん細胞株を用いて、Click反応をベースとしたL-azidohomoalanine（AHA）と質量分析によるタンパク質の網羅的同定を組み合わせ、TCTP/EF1A2の発現抑制および過剰発現によって発現変動する新生鎖ポリペプチドを網羅的に同定する。我々が開発したGene Ontology解析ツールMANGOや分子パスウェイ解析ソフトKeymolnetなどを利用したin silicoのデータマイニングによって、翻訳活性化分子群を機能分類し、腫瘍化に密接に関連する新規シグナルネットワークを推定する。抽出された分子ネットワークの機能については、生化学的・分子細胞生物学的手法によって詳細に解析する。２．TCTP-EF1A2複合体の構造生物学的解析による機能阻害の検討 TCTP-EF1A2の相互作用部位データと分子動力学（MD）計算法に基づいた構造ドッキングシミュレーションによってTCTP-EF1A2複合体の立体構造を予測する。それらの情報を基に、KEGG DrugやDrugBank等のドラッグデータベースから、TCTP/EF1A2機能を阻害する薬剤候補をin silicoにスクリーニングする。候補阻害薬を処理した細胞内において、１によって同定されたTCTP-EF1A2によって活性化される分子群の翻訳抑制状態を、網羅的な新生鎖ポリペプチドの同定によって詳細に検証する。さらにNF1腫瘍培養細胞・モデルマウスを用いて候補阻害薬の抗腫瘍効果を生化学的・細胞生物学的に検証し、NF1 治療薬として有用であるか評価する。
Causes of Carryover	TCTPとEF1A2の相互作用部位をクロスリンキング質量分析法により同定することに成功し、これらのデータに関しては論文投稿準備中である。一方で質量分析による翻訳活性測定法の構築にあたり、必要な物品調達、質量分析装置の故障対応等でCOVID-19感染拡大による影響を受け、TCTP-EF1A2複合体を介した蛋白質の翻訳制御によって活性化されるシグナル分子群の解析が遅れている状況であり、次年度に今後解析を進めていく予定である。