Development of easy-to-use genome editing protein synthesis system and one-step genetically modified animal production method

2021 Fiscal Year Final Research Report

• Project/Area Number: 19K07696
• Research Category: Grant-in-Aid for Scientific Research (C)
• Allocation Type: Multi-year Fund
• Section: 一般
• Review Section: Basic Section 50010:Tumor biology-related
• Research Institution: Keio University
• Principal Investigator: Onishi Nobuyuki 慶應義塾大学, 医学部(信濃町), 訪問研究員 (40534540)
• Project Period (FY): 2019-04-01 – 2022-03-31
• Keywords: ゲノム編集

Outline of Final Research Achievements

In this study, we developed a method to express HypaCas9 protein, which is a high-precision Cas9, and gRNA at a time using an E. coli protein expression system and purify them as ribonucleoprotein (RNP). By optimizing the selection of E. coli strains, protein expression induction conditions, and E. coli disruption method, HypaCas9 protein could be purified in a single band. Specifically, BL21 (DE3) is used instead of Rosetta2 (DE3), which is commonly used in Cas9 protein synthesis, and expression is induced at 30 °C instead of low temperature. Contaminant proteins could be reduced by disrupting E. coli under mild conditions using freeze-thaw and lysozyme instead of sonication.

Free Research Field

腫瘍生物学

Academic Significance and Societal Importance of the Research Achievements

CRISPR/Cas9ヌクレアーゼの精製タンパク質が一般に入手できるようになったことで、目的遺伝子ノックアウト細胞の作製が身近になり研究室レベルで頻繁に挑戦されるようになったが、細胞一つ一つで切断された遺伝子配列の修復様式が異なるため、クローン化する必要がある場合は細胞株樹立までに長い期間を要する。ましてや研究室単位で遺伝子改変マウスの作製を行うにはまだまだハードルが高いのが現状である。本研究を進めていくことで、迅速かつ簡便に遺伝子改変マウスを作製することが可能となり、多様な疾患ならびに治療モデルの構築に挑戦していくことで、有効な治療法が無い疾患に対して新たな治療法開発に貢献することができる。