ゲノム編集による染色体異常誘導系を用いた大腸がん進展に関わるゲノム構造異常の解析

2021 Fiscal Year Research-status Report

• Project/Area Number: 19K07701
• Research Institution: Japanese Foundation for Cancer Research
• Principal Investigator: 高野 洋志 公益財団法人がん研究会, がん研究所 細胞生物部, 主任研究員 (00241555)
• Project Period (FY): 2019-04-01 – 2023-03-31
• Keywords: 大腸がん / マウスモデル / 染色体構造異常 / ゲノム編集

Outline of Annual Research Achievements

本研究課題では、大腸がんの進展に関わるゲノム構造の異常を明らかにすることを目的として、ゲノム編集により染色体異常を誘導する新たな実験系を開発し、大腸がんモデルマウスに導入する。これにより、CNAをはじめとするゲノム異常が実際にがんの進展に寄与することを実証し、さらに、同定されたゲノム異常を詳細に解析することにより、大腸がん進展の鍵となる遺伝子を同定する。
これまで、染色体異常を誘導するためにゲノム上に多数存在する反復配列を標的としたガイドRNAを発現するマウスの作製を行ってきた。標的配列がゲノム上に多数存在するB1 SINEガイドRNA発現ユニットをROSA26遺伝子座にゲノム編集によりノックインを試みたが、目的とするマウスを樹立することはできなかった。
その一因として、反復配列を標的としたガイドRNAの恒常的な発現がマウスの発生に有害であることが考えられたことから、Cre-loxPシステムを用いてコンディショナルにB1 SINEガイドRNAを発現するシステムに変更し、このマウスの作製に成功した。このマウスとタモキシフェン依存的に腸幹細胞特異的にCreを発現するマウス（Lgr5CreERT2マウス）、Cas9コンディショナル・発現マウス、APCコンディショナル・ゲノム編集マウスを交配し、解析対象マウスを作製した。
今後、このシステムを用いて消化管腫瘍マウスで染色体異常を誘導し、ゲノム異常とがんの進展との関連を明らかにする。

Current Status of Research Progress

4: Progress in research has been delayed.

Reason

当初は、ゲノム上に1200箇所の標的配列をもつB1 SINEガイドRNA発現マウスを作製する予定であったが、目的とするマウスを得ることができなかった。標的配列が120箇所あるいは68箇所存在するB1 SINEガイドRNA発現マウスの作製も試みたが、目的とするマウスを得ることができなかった。
多数の標的配列をもつガイドRNAの恒常的な発現がマウスの発生に有害であることは予期しないことであり、計画に遅れが生じたが、Cre-loxPシステムを用いることによりコンディショナルにB1 SINEガイドRNAを発現するマウスの作製に成功したので、このマウスを用いて研究を進めていく。

Strategy for Future Research Activity

コンディショナルにB1 SINEガイドRNAを発現するマウスを用いて消化管特異的にゲノム編集を行うことにより、染色体構造異常と腫瘍形成との関連を明らかにする。
また、このシステムを消化管腫瘍モデルマウスに導入し、消化管腫瘍において染色体異常を誘導することにより、腫瘍の進展、転移との関連を明らかにする。
形成された腫瘍について、病理組織学的解析ならびに幹細胞マーカー（Lgr5やOLFM4など）や増殖細胞のマーカー（PCNAなど）、分化細胞のマーカー（LysozymeやCK15など）の免疫染色、in situハイブリダイゼーションによる発現解析を行うことにより、個々の腫瘍の性格付けを行う。さらに、これらの腫瘍からレーザーマクロダイセクションによりDNAを抽出し、SNPアレイならびに全ゲノムシーケンス解析によりCNAを検出し、ヒト大腸がんで明らかにされているCNAデータと比較
検討することにより、がんの進展・悪性化に関わるゲノム領域を同定を目指す。