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2019 Fiscal Year Research-status Report

in vitro分化誘導した長期生存形質細胞を用いた革新的薬剤投与法の開発

Research Project

Project/Area Number 19K07747
Research InstitutionAichi Cancer Center Research Institute

Principal Investigator

羽根田 正隆  愛知県がんセンター(研究所), 腫瘍免疫制御TR分野, 研究員 (50436995)

Project Period (FY) 2019-04-01 – 2022-03-31
Keywords形質細胞 / ナイーブB細胞 / ゲノム編集 / 抗体医薬
Outline of Annual Research Achievements

研究のゴールは、末梢血中のナイーブB細胞をゲノム編集により元々の抗体産生機能を欠失させ、同時に抗体医薬をノックインし産生できる長期生存形質細胞に分化誘導することである。長期生存形質細胞はタンパク質合成能や分泌能に優れており、また自己由来の形質細胞であることから、自己への移植が可能である。長期生存形質細胞は極めて長寿命であり、生着したのち長期間抗体医薬を産生し続けるため、繰り返し薬剤を投与する必要がなくなると考えられる。
本年度は、イムノグロブリン遺伝子(IgH,IgK,IgL)に対するゲノム編集用gRNAの選定を行うため、Webサイト上のCHOPCHOP(https://chopchop.cbu.uib.no/)およびIDT社(https://sg.idtdna.com/site/order/designtool/index/CRISPR_SEQUENCE)のCRISPR-Cas9 guide RNA design checkerを利用した。V(D)J領域は複数あり、ターゲットとしては不適切と考え、定常領域に絞って設計を行った(重鎖:IgM, IgA, IgE, IgG1,2,3,4、軽鎖:IgL, IgK)。軽鎖IgLでは設計出来ず、IgKのみ設計を行った。B細胞におけるIgLとIgKの存在比は1:2とされているので、今後の培養系研究ではIgKを持つB細胞のみで研究を行うこととした。
培養系での実験を行う前にin vitroでのgRNAの実際のDNA切断効果について検討を行った。
今後は、活性化B細胞に対して本年度に選定したgRNAとCas9タンパク質を導入し、イムノグロブリン遺伝子の定常領域を切断、実際に変異導入効率の高いgRNA配列を決定し、抗体産生を除去した形質細胞培養系の確立を行う予定である。

Current Status of Research Progress
Current Status of Research Progress

3: Progress in research has been slightly delayed.

Reason

webサイト上でゲノム編集用gRNAの選定を行い、培養系で活性化B細胞におけるgRNAのゲノム編集効率の解析まで研究を進める予定であった。
しかし培養系での実験を行う前にin vitroでのgRNA切断効果について解析を行い、実際にDNA切断効率を検討した。効率が良いと予測される配列であっても実際の切断効率は異なっており、より有効なgRNAの検討を行うことが出来た。
今後はこの結果をもって活性化B細胞におけるgRNAのゲノム編集効率について解析を進める予定である。

Strategy for Future Research Activity

R2年度は、抗体産生能を欠失した長期生存形質細胞の培養法の確立する。活性化B細胞に対してR1年度に選定したgRNAとCas9タンパク質を導入し、イムノグロブリン遺伝子の定常領域を切断、効率を定量化し、実際に変異導入効率の高いgRNA配列を決定する。
次に、抗体産生能を欠失した形質細胞の培養系の確立を行う。また、モノクローナル抗体遺伝子を移入した、目的の抗体を産生する形質細胞の培養法の確立する。
R3年度以降は、マウスを用いて、生体内でのモノクローナル抗体産生形質細胞の挙動および生存率について解析を行う。

Causes of Carryover

培養系での実験を行う前に、in vitroでのgRNAの遺伝子切断効率について検討を行い、適切なgRNAの選別することが出来た。培養関係の試薬の購入が次年度になったため、初年度予定した使用額より少額となった。
R2年度は、選別したgRNAを用いた遺伝子導入効率や切断効率について、培養系での検討を行う。ゲノム編集によりイムノグロブリン産生を欠失した形質細胞や、遺伝子移入されたモノクローナル抗体を産生する形質細胞を創出する予定である。

URL: 

Published: 2021-01-27  

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