in vitro分化誘導した長期生存形質細胞を用いた革新的薬剤投与法の開発

2023 Fiscal Year Research-status Report

• Project/Area Number: 19K07747
• Research Institution: Aichi Cancer Center Research Institute
• Principal Investigator: 羽根田 正隆 愛知県がんセンター(研究所), 腫瘍免疫制御TR分野, 研究員 (50436995)
• Project Period (FY): 2019-04-01 – 2025-03-31
• Keywords: 形質細胞 / ナイーブB細胞 / ゲノム編集 / 抗体医薬

Outline of Annual Research Achievements

研究のゴールは、末梢血中のナイーブBリンパ球をゲノム編集により元々の抗体産生機能を欠失させると同時に抗体医薬をノックインし長期生存形質細胞へと分化誘導することである。長期生存形質細胞を利用できれば抗体医薬を産生し続けることで繰り返し薬剤を投与する必要がなくなり、医療経済的にも有用な手段と考える。
昨年度、IgHμの定常領域CH1のシステインの前方に存在するPAMサイトをターゲットとしたgRNA、IgHδの定常領域CH1のシステインの前方に存在するPAMサイトをターゲットとしたgRNA、Igκの定常領域の１つ目のシステインの後方に存在するPAMサイトをターゲットとしたgRNAを設計作成し、それぞれを順次ノックダウンすることで、IgM, IgK, IgDの発現しないB104クローンを樹立することができた。
しかしながら、これらのB104クローンからはIgHμの超可変領域および定常領域、IgHδの超可変領域および定常領域、Igκの定常領域のノックダウンされていない領域から翻訳される低分子タンパク質が分泌されることが判明した。低分子タンパク質ではあるものの、これらの蓄積により、医原性アミロイドーシスを引き起こす可能性が否定できないため、研究計画の練り直しが必要となった。
定常領域はIgHμ、IgHδ、Igκの基本骨格であり、どの超可変領域を使用していても共通に使用されるため、この部位をノックダウンすれば全てのB細胞で免疫グロブリンを分泌しない形質細胞を作成することが出来るのであるが、医原性アミロイドーシスを引き起こす可能性が否定できない低分子タンパク質を分泌させないためには、超可変領域をターゲットとしたPAMサイトを選定することが必要となった。

Current Status of Research Progress

4: Progress in research has been delayed.

Reason

定常領域はIgHμ、IgHδ、Igκの基本骨格であり、どの超可変領域を使用していても共通に使用されるため、この部位をノックダウンすれば全てのB細胞で免疫グロブリンを分泌しない形質細胞を作成することが出来るのであるが、上記低分子タンパク質を分泌させないためには、超可変領域をターゲットとしたPAMサイトを選定することが必要となった。
NCBI geneよりIGK, IGHのプロモーター領域を全て抽出しmultiple alignmentを行い、プロモーター領域において共通する遺伝子発現制御・促進領域がないか検討を行ったが、免疫グロブリンのみを制御できる領域や共通する領域を抽出することはできなかった。
超可変領域には比較的偏りがあるといった報告があり、特にレパートリーに選択されるIGK variable遺伝子には、IGKV1-39、IGKV3-20、IGKV3-11、IGKV1-5がよく使用される傾向にある（Molecular Immunology.2015,65,215-223）といった報告が、レパートリーに選択されるIGH variable遺伝子には、プロB細胞の段階では、IGHV4-34、IGHV4-39、IGHV4-59、IGHV3-23、IGHV3-30が最も頻繁に再構成されている(J Immunol. 1999.163.2732-2740) といった報告がみられた。またIGK variable遺伝子・IGH variable遺伝子を同時に解析した報告もみられた(Genes & Immunity.2012.13.469-473)。これらの中からナイーブB細胞において比較的優位に使用されるIGK variable遺伝子およびIGH variable遺伝子の超可変領域をターゲットとしたPAMサイトを選定した。

Strategy for Future Research Activity

比較的優位にレパートリーに選択されるIGH variable遺伝子のうちIGHV3-7・IGHV3-23・IGHV3-30・IGHV4-4・IGHV4-34・IGHV4-59についてPAMサイトを選定できた。
またIGK variable遺伝子のうちIGKV1-5についてPAMサイトを選対したが、このサイトはIGKV1-9・IGKV1-27・IGKV1-33・IGKV1-37・IGKV1-39・IGKV1D-39・IGKV1D-37・IGKV1D-33・IGKV1D-27・IGKV1D-16と共通であり、同時にノックダウンすることが出来るPAMサイトを選定することが出来た。引き続きIGK variable遺伝子のうちIGKV3-20、IGKV3-11についてPAMサイトの選定を行う。
これらのPAMサイトをターゲットとしたgRNAを設計作成し、ノックダウンの効果をヒト末梢血ナイーブB細胞を用いて解析を行う予定である。

Causes of Carryover

前年度設計したPAMサイトでノックダウンを行っても不必要かつ医原性アミロイドーシスを引き起こす可能性のある低分子タンパク質が分泌されることが判明した。そのため研究計画の練り直しが必要となった。
定常領域はIgHμ、IgHδ、Igκの基本骨格であり、どの超可変領域を使用していても共通に使用されるため、この部位をノックダウンすれば全てのB細胞で免疫グロブリンを分泌しない形質細胞を作成することが出来るのであるが、上記低分子タンパク質を分泌させないためには、超可変領域をターゲットとしたPAMサイトを選定することが必要となった。
比較的優位にレパートリーに選択されるIGH variable遺伝子のうちIGHV3-7・IGHV3-23・IGHV3-30・IGHV4-4・IGHV4-34・IGHV4-59についてPAMサイトを選定できた。またIGK variable遺伝子のうちIGKV1-5についてはIGKV1-9・IGKV1-27・IGKV1-33・IGKV1-37・IGKV1-39・IGKV1D-39・IGKV1D-37・IGKV1D-33・IGKV1D-27・IGKV1D-16と共通のPAMサイトを選定することが出来た。
これらのPAMサイトをターゲットとしたgRNAを設計作成し、ノックダウンの効果をヒト末梢血ナイーブB細胞を用いて解析を行う予定である。