2021 Fiscal Year Research-status Report

マイコプラズマ由来アルギニン代謝制御蛋白質を標的とした新規がん免疫療法の開発

Research Project

Project/Area Number	19K07764
Research Institution	Fukuoka University
Principal Investigator	西中川拓也福岡大学, 薬学部, 助教 (30600035)
Project Period (FY)	2019-04-01 – 2023-03-31
Keywords	免疫逸脱機構 / 抗体医薬品 / マイコプラズマ
Outline of Annual Research Achievements	がんの発生や進展には、遺伝や環境など、種々の要因が関与しているが、そのひとつに微生物の感染が挙げられる。近年、がん細胞へのマイコプラズマ感染が病態の発症や進行に関わっていることが報告されており、その分子基盤の解明が急務である。本研究の目的は、がん細胞に感染したマイコプラズマが産生・分泌する免疫抑制性分子Arginine Deiminase (ADI) に対して、特異性の高いマウスモノクローナル抗体を複数クローン樹立することで、血清学的臨床診断やがんの予後診断、さらには中和抗体としての可能性を探索するとともに、ADIによる細胞障害機構を明らかにし、がんの新規治療法開発へ貢献することである。本年度は、樹立したマウスモノクローナル抗体の分子生物学的研究における有用性についての検討を行った。その結果、樹立抗体は、細胞染色やWestern Blotting法、ELISA法など様々なアプリケーションに応用可能であることが確認できた。樹立抗体は、目的分子の基礎的研究に加え、患者血清やがん組織を用いた臨床研究にも応用できる可能性がある。また、目的分子を産生・分泌するマイコプラズcDNAより、目的分子をコードする遺伝子を単離し、その遺伝子配列を同定した。これまでに、マイコプラズマは120種以上の亜型が知られており、それら亜型間のアミノ酸配列変化や翻訳後修飾の差異により、生物活性が異なることが報告されている。そのため、目的分子の遺伝子配列の同定ならびに一次アミノ酸構造の決定は、目的分子の生物学的特性の解析や細胞障害活性部位の解明において重要な知見となる。
Current Status of Research Progress	Current Status of Research Progress 3: Progress in research has been slightly delayed. Reason 本研究では、がんに感染したマイコプラズマが産生・分泌する免疫抑制性分ADIに対するマウスモノクローナル抗体の樹立 (特に細胞障害活性に対する中和抗体) ならびにADIの構造解析を目的としている。 ADIの構造解析において、がん感染マイコプラズマのcDNAよりADIをコードする遺伝子の単離に成功しており、ADIの遺伝子配列およびアミノ酸一次構造を明らかとした。一方で、ADIに対するマウスモノクローナル抗体の樹立において、Western Blotting法やELISA法など様々な分子生物学的研究に応用できるハイブリドーマクローンの樹立に成功しているが、中和抗体の樹立には至っていない。本研究の標的であるADIは、マウス抗体産生系を抑制することを我々は見出している。そのため、本研究では、ADIを免疫原として使用する際に不活化処理を行っている。不活化処理によりADIの活性部位の構造変化等をきたし、活性部位を認識する中和抗体の樹立を困難にしている可能性が考えられる。
Strategy for Future Research Activity	今後の研究方策は以下の通りである。 ①ADIの生物学的機能解析：前年度に明らかにしたADIの遺伝子配列を基にリコンビナントタンパクを作製し、細胞障害活性部位の同定を行う。また、ADIをコードするプラスミドをADIの標的となる細胞に導入し、細胞障害活性のシグナル解析を行う。 ②ADIの中和抗体の樹立：前年度に引き続き、中和抗体の樹立を目指す。これまでは、免疫原となるADIの不活化処理として、トリクロロ酢酸によるタンパク変性を行っていたが、加熱処理による不活化など、新たな不活化処理を取り入れる予定である。
Causes of Carryover	マイコプラズマ産生ADIに対する中和抗体を樹立するために、新たなマウスに対する免疫およびハイブリドーマの作製を計画していた。しかしながら、新型コロナウイルスの影響により当初予定していた動物実験を行うことが困難となったため、動物関連費用や免疫用試薬購入費などを繰り越し、動物実験を次年度に行う予定である。また、本研究では、ADIの構造解析も併せて行っているが、ADIの生物活性部位の同定に成功すれば、生物活性部位を含む合成ペプチドを免疫原とすることで、より効率的に生物活性部位をターゲットとした中和抗体の樹立が期待できる。