Development of diagnostic technique of pancreatic cancer by using liquid biopsy targeted DNA methylation markers

2021 Fiscal Year Annual Research Report

• Project/Area Number: 19K07771
• Research Institution: Tohoku University
• Principal Investigator: 顧 兆悌 東北大学, 医学系研究科, 非常勤講師 (40451520)
• Co-Investigator(Kenkyū-buntansha): 元井 冬彦 山形大学, 医学部, 教授 (30343057) ; 畠 達夫 東北大学, 医学系研究科, 大学院非常勤講師 (30806237) ; 福重 真一 東北大学, 医学系研究科, 特任教授 (90192723)
• Project Period (FY): 2019-04-01 – 2022-03-31
• Keywords: 癌 / ゲノム / 遺伝子 / 膵癌 / DNAメチル化 / リキッドバイオプシー / qMSP

Outline of Annual Research Achievements

膵癌は、5年生存率が10％未満という予後不良の難治癌である。膵癌の早期診断には血漿中の癌特異的ドライバー遺伝子変異や蛋白マーカー値の変化を調べる「リキッドバイオプシー」が有効であるが、臨床応用には、さらなる検出感度の向上が重要である。本研究では、我々が独自に開発した高メチル化遺伝子探索法MeTAにより膵癌特異的に高率にメチル化され、転写抑制される6遺伝子（NEFL、NEFM、NEFH、NPTX2、IRX4、LHX6）のDNAメチル化を標的とするリキッドバイオプシーの技術開発をおこない、早期診断への可能性や予後との関連を調べることを目的とした。
本年度は、10症例（PDAC: 7、IPMN: 2、CP: 1）の患者血漿 2 mLからQIAGEN社のQIAamp Circulating Nucleic Acid Kitを用いてリキッドバイオプシーに用いるcfDNAを抽出し、DNA量、品質について検討した。その結果、血漿2 mLから得られたcfDNA量は平均17.4 ng（8.7～38.3 ng）であった。また、バイオアナライザーによる品質チェックの結果、162～173 bpの単一バンドが観察されたのみで、より高分子のバンドのラダーは見られなかった。EpiTect Bisulfite Kitを使用してさらにバイサルファイト処理をおこない、内在性コントロールであるβアクチンプロモーター領域、膵癌で高メチル化が知られるPCDH10プロモーター領域、6遺伝子のうち最も臨床検体でメチル化頻度が高かったNEFMプロモーター領域のqMSP（定量メチル化PCR）をおこなった。PCDH10、NEFMのPCR産物は全く見られず、βアクチンに関してもCT値は34～38であった。これらは、膵癌患者の血漿から得られたcfDNAの量、品質があまりよくないことを反映していると考えられた。