Identification of novel cell surface antigens for cancer stem cells using single-cell technology

2021 Fiscal Year Research-status Report

• Project/Area Number: 19K07776
• Research Institution: Kyushu University
• Principal Investigator: 今野 大治郎 九州大学, 生体防御医学研究所, 准教授 (00362715)
• Co-Investigator(Kenkyū-buntansha): 立花 太郎 大阪市立大学, 大学院工学研究科, 教授 (80311752)
• Project Period (FY): 2019-04-01 – 2023-03-31
• Keywords: がん幹細胞 / グリオーマ / グリオブラストーマ / 膠芽腫

Outline of Annual Research Achievements

本年度は昨年度に引き続き、マウス人工グリオーマ幹細胞（Glioma-Initiating Cell: GIC）を抗原としたラット腸骨リンパ節法により樹立したハイブリドーマの産生モノクローナル抗体の性状解析を進めた。具体的には、昨年度に樹立に成功したクローン5E4の解析を進めた。5E4抗体はヒトグリオーマ由来細胞株においてもGICに顕著な反応性を示す一方、non-GICへの反応性は認められなかったことから、グリオーマ幹細胞をターゲットとした抗体医薬品としての高いポテンシャルを有していることを示唆している。そこで本年度はクローン5E4の2ndスクリーニングと抗原同定を中心に実験を行った。2ndスクリーニングでは限外希釈法により5E4-2A3および5E4-3A5という2つのモノクローナル抗体の樹立に成功した。次にこれらモノクローナル抗体が認識する抗原分子の同定を免疫沈降法により試みた。しかしながら、抗原と思われる分子の同定には至らなかった。そこで引き続き抗原分子の同定を目的として、可溶化方法の変更を含む免疫沈降法の条件検討を進めている。また、抗原が膜タンパク質であることが予想されることから、生化学的手法による抗原同定は難航することが予想される。そこで、マウスGIC細胞の遺伝子発現ライブラリーを作製し、それらを用いた免疫染色スクリーニングによる抗原同定をバックアッププラントとして同時に進める計画である。

Current Status of Research Progress

3: Progress in research has been slightly delayed.

Reason

マウスおよびヒトGICに高選択的に反応するクローンである5E4の2ndスクリーニングを実施し、2つのモノクローナル抗体の樹立に成功した。しかしながら、それらの抗体が認識する抗原の同定には至らなかった。樹立したモノクローナル抗体は細胞を生きた状態で認識することが明らかとなっていることから、認識抗原は細胞膜タンパク質であることが予想されるため、引き続き生化学的解析に用いる可溶化剤の変更など、免疫沈降法のさらなる条件検討が必要である。

Strategy for Future Research Activity

樹立に成功した2つの5E4由来モノクローナル抗体の性状解析及び抗原同定を進め、5E4抗体の細胞増殖に対する影響や抗体依存性細胞傷害（ADCC）の有無などを評価することで、5E4抗体の医薬品としての可能性を引き続き評価する。また、培養細胞を用いた予備的実験結果ではあるが、5E4抗体がエクソソームを含む細胞外小胞上に存在する抗原を認識することが示唆された。そこで、GICを移植したマウスから採取した血液や尿など体液中に存在するGIC由来エクソソームを5E4抗体が検出可能かを検証し、細胞外小胞の検出を基盤としたがんの早期診断法への応用の可能性を探る。

Causes of Carryover

実験計画の進展により部分的に計画を変更し、単離したモノクローナル抗体5E4の解析に注力したが、一部の実験で想定通りに結果が得られなかったため次年度使用額が生じた。また、コロナ禍の影響により各種消耗品等の納品に時間を要し、実験計画の一部停止を余儀なくされた。これらの問題点はすでに解決されているため、次年度は修正済み計画に従って実験を実施する。