大腸癌の高度危険度群マウスにおけるFusobacteriumの役割

2020 Fiscal Year Research-status Report

• Project/Area Number: 19K07779
• Research Institution: Saitama Medical University
• Principal Investigator: 鈴木 興秀 埼玉医科大学, 医学部, 講師 (90726324)
• Co-Investigator(Kenkyū-buntansha): 堀内 大 埼玉医科大学, 医学部, 講師 (30608906)
• Project Period (FY): 2019-04-01 – 2022-03-31
• Keywords: 大腸癌 / マイクロサテライト不安定性 / Fusobacterium / 臨床検体 / 細菌DNA検出系 / 動物モデル

Outline of Annual Research Achievements

Lynch 症候群の大腸癌はマイクロサテライト不安定性(MSI-high)を有し、その結果として、腫瘍細胞の体細胞遺伝子変異に由来する新規癌抗原(neoantigen)が出現しやすいことが示唆されている。近年、進展した大腸癌組織からGram陰性嫌気性細菌Fusobacterium nucleatum (F. nucleatum)が高頻度に検出されることが報告されている。以上を鑑み、本研究では、Lynch 症候群に由来する大腸癌の進展にF. nucleatumが及ぼす影響を明らかにすることを目指す。本年度までに、大腸癌臨床検体腫瘍部位からの細菌ゲノムDNA抽出とリアルタイムqPCR解析の検討を重ね、安定したF. nucleatum検出系を構築することができ、解析を進めている。また、F. nucleatum特異的な核酸プローブを用いたin situ hybridization法により大腸癌組織におけるF. nucleatumの局在様式を検討したところ、腫瘍組織においてfocalな分布傾向が明らかとなった。2020年度は、安定して複数のF. nucleatum株が嫌気培養できるようになり、それを用いてin vitro実験系の樹立に取り組んだ。その結果、大腸癌細胞株培養系にF. nucleatumを接種すると、一定時間経過後に細胞増殖が促進されることが確認された．

Current Status of Research Progress

2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.

Reason

前年度に引き続き、1) F. nucleatum感染によるLynch症候群モデルマウス確立に向けてのマウス自家繁殖の安定化と遺伝型解析の安定実施体制の構築、2)腫瘍検体からのFusobacteriumの検出系の確立の２点に取り組んでいる。
1)に関しては、Msh2loxP/loxP とVillin-Creマウスの掛け合わせによる繁殖効率が思うように上がらず、Lynch症候群モデルマウスとなるF1マウスの匹数確保に苦慮している。
2)に関しては、昨年度に引き続き、大腸癌の臨床的分類とFn検出の関連性について検討を重ね、一定のパターンを示唆するデータが集まりつつある。本年度は新たに、3) F. nucleatumの嫌気培養の安定化と、4) 大腸癌細胞株培養系を用いたF. nucleatum感染のin vitro実験の確立に取り組んだ。
3)に関しては、F. nucleatum 3株の嫌気培養を安定して実施できるようになり、培養された菌を用いての実験が可能となった。4)に関しては、大腸癌細胞株培養系へのF. nucleatumの接種により、細胞の増殖が促進されうることを示唆する結果が得られた。
1)に関しては進捗にやや課題が残るが、 ２）、３）、４）の結果より、本研究はおおむね順調に進展していると判断した。

Strategy for Future Research Activity

Msh2loxP/loxP マウスとVillin-Creマウスを掛け合わせによるF1マウス（消化管特異的にマイクロサテライト不安定性(MSI-high)を持つ）の繁殖効率の向上に努め、十分な匹数を確保出来次第、F. nucleatumの感染実験を含めたin vivo実験を詳細に進める。具体的にはF. nucleatumを感染させたモデルマウスの腫瘍発生率や腫瘍の組織型、免疫細胞浸潤について、F. nucleatumが存在しないモデルマウスのものと比較して、MSI-high生体内の腫瘍病態進展にF. nucleatumが及ぼす影響を精査する。
加えて、臨床検体の解析を進め、マウスモデルを用いて解析すべきイベントの抽出に取り組む。

Causes of Carryover

当該年度は学会発表を行うには至らず、学会参加費及び旅費を使用しなかった。また、予定していたin vivo実験もマウス匹数の問題から実施できていない。以上が、次年度使用額が生じた主な理由である。次年度はin vivo感染実験から得られる腫瘍検体を用いた病理学的解析や腫瘍浸潤白血球の免疫学的解析などの実施を予定しており、各種ラベル抗体や細胞分離試薬、細胞培養用プラスチック器具、培地などが必要となる。次年度使用額は、これらの購入費に併せて充てる。