2019 Fiscal Year Research-status Report
痛覚鈍麻マウスを用いた順遺伝学的スクリーニングによる新たな疼痛制御因子の同定
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19K07827
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| Research Institution | Nara Medical University |
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Principal Investigator |
田中 達英 奈良県立医科大学, 医学部, 講師 (80567032)
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| Co-Investigator(Kenkyū-buntansha) |
辰巳 晃子 奈良県立医科大学, 医学部, 准教授 (90208033)
和中 明生 奈良県立医科大学, 医学部, 教授 (90210989)
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| Project Period (FY) |
2019-04-01 – 2022-03-31
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| Keywords | 疼痛 / マクロファージ |
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| Outline of Annual Research Achievements |
痛みは身体の異常を感知して警告信号を発信する重要な役割を果たす。しかし、痛みは様々な疾病においてQOLを著しく低下させる因子でもある。疼痛の発生メカニズム及び神経系における伝達機構は多様でありその全貌は明らかではない。我々は、別の研究テーマで使用しているBACトランスジェニックマウス（以下、TGマウス）が、痛み刺激に対する反応が著しく低下していることを偶然に発見した。
TGマウスはBACトランスジェニックマウスであるため、我々は当初、BAC内に含まれた遺伝子こそが疼痛機序に重要であると考えたが、当該遺伝子の発現は野生型マウスと比較しても変動せず、また疼痛の発生に寄与しないことを見出している。そこで我々は、TGマウスではBACトランスジーンの挿入によって、内在性の遺伝子の発現が阻害または変動した結果、疼痛刺激に対する行動変化が起きたと仮説を立てた。次世代シークエンスを用いた順遺伝学的なスクリーニングにより、トランスジーン挿入部位近傍の3つ遺伝子制御が完全に破綻していることを見出した。本研究では、同定された候補因子の中で細胞膜の動態や細胞内トラフィッキングに関与する因子、Sorting nexin (Snx)に着目した。
Snx-KOマウスはTGマウス同様に痛み行動の減弱と免疫系細胞の異常が認められた。また、WTおよびSnx-KOマウスからDRGニューロンを調整し、Ca imagingを行なった結果、Snx-KOマウス由来のDRGニューロンでは発痛物質に対する反応が有意に減弱していることを見出した。さらに、疼痛発生時に機能が亢進する疼痛関連因子(TRPV1, Nav1.7, P2X3, Trk等)の発現を調べた結果、Snx-KOマウスではDRGにおけるこれらの発現が著しく低下していることを見出している。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
我々はこれまで、TGマウスおよびSnxヘテロKOマウスにおいて化学刺激（5% ホルマリンを後肢皮膚にinjection）後の末梢マクロファージでサイトカインやケモカイン発現量が減少していることを見出している。本研究ではまず、SnxヘテロKOマウスで炎症性因子の発現のみならず、マクロファージの遊走能、炎症メディエーター分泌能が野生型(WT)と差異が認められるかを解析したところ、遊走能が顕著に低下していることを見出すことができた。
SnxヘテロKOマウスはTGマウス同様、痛み行動が減弱する。我々は末梢の免疫系細胞におけるSnxにより疼痛が惹起されると仮説を立てているが、SnxヘテロKOマウスでは詳細な疼痛機序が見い出せない。Snxが疼痛に及ぼす責任部位は本当に免疫系細胞か、または痛みの伝導に関わるDRGか、あるいは両方かを明らかにするためには部位時期特異的なKOマウスの解析が必須となる。そこで、マクロファージ特異的(Lysozyme M-Creマウス, Cx3cr1-CreERT2マウス)、およびDRG特異的(Advillin-Creマウス)にSnxをKOしたconditional-KOマウス(タモキシフェン誘導型)を作製した。現在、どちらのconditional-KOマウスで痛み行動が減弱するかを調べている。
Snx蛋白質には複数のドメイン構造が存在し各々が膜輸送に重要な機能を有すると考えられる。そこで、各ドメインの欠損コンストラクトを作製し膜輸送動態がどのように変化するかを解析している。また、各ドメイン欠損コンストラクトをマクロファージに導入し、疼痛発生に重要な機能を果たす遊走能、炎症メディエーター分泌能が抑制されるかを検討したところ、phox homology (PX)ドメインが特に重要であることが明らかになった。
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| Strategy for Future Research Activity |
これまで用いているTGマウス、Snx-KOマウスと新たに作製したconditional-KOマウスを用いて、同定遺伝子の欠損がなぜ機械刺激と化学刺激誘発性疼痛行動を抑えるのかについて解析する。Snxは細胞内においてエンドゾームに局在し、膜局在する物質の輸送に関わる因子である。Snxのカーゴ（積み荷）は何かを明確にするため、これまで候補に挙がっている数種類のカーゴ因子について293T細胞を用いて免疫沈降法で明らかにする予定である。
これまで、マクロファージに これらのマウスでは一次求心性線維における活動電位や脊髄へのシナプス入力が変化している可能性があるため、DRGにおける活動電位伝導および脊髄後角におけるC線維誘導性興奮性シナプス後電流を電気生理学手法で記録する。
また、TGマウス、Snx-KOマウス、作製したconditional-KOマウスともにマクロファージの機能に異常がみられることを見出しているが、構造的に異常がみられるのか、特にオルガネラ構造が損なわれていないかを電子顕微鏡で観察する予定である。
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