ノックインゼブラフィッシュを用いたヒトα-シヌクレインの炎症応答性の解析

2020 Fiscal Year Research-status Report

• Project/Area Number: 19K07838
• Research Institution: Chiba University
• Principal Investigator: 守屋 彰悟 千葉大学, 大学院医学研究院, 特任講師 (00793837)
• Project Period (FY): 2019-04-01 – 2022-03-31
• Keywords: α-シヌクレイン / ゼブラフィッシュ

Outline of Annual Research Achievements

レビー小体病はα-シヌクレインの異常凝集体を主な構成成分とするレビー小体の存在を特徴とする神経変性疾患の一つである。α-シヌクレインはそのポリマーや異常凝集体が細胞への毒性を示すことから、レビー小体病の発症機構への関与が強く示唆されているものの、その異常凝集体の形成機構の詳細は未だ明らかになっていない。炎症反応がα-シヌクレインのポリマー化や異常凝集体形成へ影響を及ぼしていることが考えられるため、本課題では炎症に対するα-シヌクレインの応答性を解析することを目的とする。1年目はゼブラフィッシュにゲノム編集技術であるCRISPRシステムを用いてヒトα-シヌクレイン遺伝子をノックインすることを試みたが、2年目となる本年度はトランスポゾンを用いてヒトα-シヌクレインをノックインする方法も試みた。その結果、CRISPRシステムでは生殖細胞にノックインされた個体が見られなかった一方、トランスポゾンを用いた方法では生殖細胞にノックインされた個体が確認された。そこでトランスポゾンを用いてノックインしたゼブラフィッシュを用いて、ヒトα-シヌクレインの局在の観察を行った。さらにwestern blotting法によるヒトα-シヌクレインタンパク質凝集体の解析法を確立し、作成したゼブラフィッシュを用いてヒトα-シヌクレインタンパク質の解析を行った。さらに、ヒトα-シヌクレイン発現によって生じる遺伝子発現変化を解析するため、RNA-seq法によりトランスクリプトーム解析を行った。本課題申請時点で注目していたシャペロンやプロテアソーム関連遺伝子、オートファジー関連遺伝子の解析のみならず、その他の遺伝子の解析も行い、凝集関連遺伝子の抽出を行った。

Current Status of Research Progress

2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.

Reason

1年目にゲノム編集によってヒトα-シヌクレインをノックインする予定としていたが、生殖細胞へノックインした個体が得られずやや遅れていたものの、2年目となる本年度にトランスポゾンを用いてノックインすることによって目的とする個体を得た。この個体を用いて2年目以降の予定としているα-シヌクレイン凝集の解析と凝集関連遺伝子の同定を進めている。本年度はwestern blotting法による凝集の解析やRNA-seqによるトランスクリプトーム解析により凝集関連遺伝子の抽出を行っており、1年目にでた遅れを取り戻し、おおむね順調に当初の予定通り進んでいる。

Strategy for Future Research Activity

本課題最終年度となる来年度は本年度抽出した凝集関連遺伝子の凝集体形成への関与を解析し、凝集体形成機構を明らかにする予定である。さらに、炎症反応がそれら遺伝子へ及ぼす影響を解析することで炎症に対するα-シヌクレインの応答性の解析を進める。一方、今までに出た成果をとりまとめ論文として公表する準備も進める。