2020 Fiscal Year Research-status Report
Mechanisms of epigenetic regulation of glod-4/GLO1 gene in C. elegans
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19K07842
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| Research Institution | Kanazawa University |
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Principal Investigator |
原田 真市 金沢大学, 医学系, 准教授 (90272955)
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| Co-Investigator(Kenkyū-buntansha) |
原島 愛 金沢大学, 医学系, 助教 (50705522)
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| Project Period (FY) |
2019-04-01 – 2022-03-31
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| Keywords | 線虫 / Glyoxalase |
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| Outline of Annual Research Achievements |
慢性疾患は、生体内でさまざまな障害を引き起こし、その障害発声のメカニズムを理解することは、治療法を特定し、疾患を軽減することにつながる。終末糖化産物（AGE）は受容体であるRAGEを介して、慢性疾患、特に炎症や代謝機能障害を特徴とする疾患に関与している。AGEには多くのレパートリーが存在し、自己免疫、慢性炎症、肥満、糖尿病、神経変性などに関与している。我々は、モデル生物である線虫C. elegansを用いてAGEレパートリーの中でも特に毒性が高いとされるメチルグリオキサール（MG）の神経系への作用を明らかにするとともに、MG代謝・解毒に関与する酵素Glyoxalaseと神経系障害発生とその防御機構の分子基盤を明らかにすることを目的としている。
線虫C. elegansでは、未だRAGE遺伝子の存在は明らかになっていない。しかし、ブドウ糖や果糖などの糖質が代謝されることで生じるMGなどの中間体の蓄積から、それらは強く細胞毒性を示し、寿命に影響を及ぼすとされている。そこで、線虫C. elegans Glyoxalase遺伝子glod-4の機能解析のため、Glyoxalase遺伝子を過剰発現させたトランスジェニック線虫でのMG負荷試験による寿命の解析を試みた。
また、エピジェネティック解析のためのglod-4遺伝子上流域解析の検討を行なった。ヒトGLO1遺伝子のプロモーター領域にはantioxidant-response element(ARE)配列の存在が知られており、この領域に結合すると推定される転写因子としてのNrf2は、線虫C. elegansのSKN-1ホモログである。ヒト同様に線虫C. elegans glod-4遺伝子上流域におけるARE配列を比較検討した。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
3: Progress in research has been slightly delayed.
Reason
野生株N2、glod-4変異体及びC. elegans Glyoxalaseを過剰発現した株を対象として、MG負荷による寿命を測定しKaplan-Meierによる生存曲線を得た。MGの濃度を10μMから10mMの範囲で負荷したそれぞれの寿命は、ほぼMG濃度依存的に減少し、10mM MGでの最大寿命は野生株N2で22日、glod-4変異体で17日、トランスジェニック株では28日であった。また、RNAiによるノックダウン解析のために線虫cDNA clone C16C10.10の配列情報を元にRT-PCRで増幅しglod-4 cDNAを持つRNAiベクターを作製した。野生株N2へのRNAiでは最大寿命は20日で、10mM MG負荷の野生株N2ではさらに最大寿命が短く18日でありこれまでの報告とほぼ一致する結果であった。
MG負荷による寿命解析において、条件検討や再現性の確認に相当な時間を費やしたことにより行動の定量解析においては条件検討の段階であり、当初の予定よりも遅れている。顕微鏡下での観察では前進・後退運動に差があるように感じられるが、成虫期ステージ間においても運動に差が生じているため、頭部刺激、または尾部刺激によるレスポンスの有無による解析を同時に進めている。また、線虫C. elegans Glyoxalaseを過剰発現させた線虫株はレポーターとしてGFPを含んでおり、蛍光タンパク質を指標とした神経細胞での活性の定量化をMG負荷の有無で試みている。
線虫C. elegans glod-4遺伝子上流域とヒトGLO1遺伝子上流域の転写調節領域のDNA配列の比較からARE配列の存在の有無を検索したが、相同性領域の特定には至っていない。
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| Strategy for Future Research Activity |
glod-4/GLO1遺伝子のエピジェネテック解析のためにはこれら遺伝子の制御に関与すると考えられるSKN-1/Nrf2遺伝子が、実際に転写因子として両遺伝子上流域の特定配列に結合するかどうかを見極めることが必要である。線虫C. elegansではこれまでに多くの変異体が単離されている。そこで、SKN-1遺伝子変異体とglod-4遺伝子変異体の二重変異体を作製し、これまでに検討してきた寿命解析や次年度解析予定の行動・運動表現型、さらにはglod-4遺伝子RNAiを用いた解析からSKN-1遺伝子の関与を探る。転写調節領域の特定には、glod-4遺伝子上流域欠失変異体を作製し、glod-4/GLO1遺伝子の発現量を調べることで絞り込む。また、ヒトGLO1遺伝子上流域を線虫C. elegans glod-4遺伝子上流域と交換した場合の発現を比較検討することで詳細な転写調節領域を明らかにする。
転写調節領域が絞り込めたのち、線虫C. elegansヒストン修飾酵素変異体を用いた遺伝学的解析からクロマチン構造と転写制御機構の関係を明らかにする。
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