2021 Fiscal Year Research-status Report

内臓痛の伝達に関与する脊髄内神経回路とその構築を制御する分子基盤の解明

Research Project

Project/Area Number	19K07855
Research Institution	Kansai Medical University
Principal Investigator	西田和彦関西医科大学, 医学部, 助教 (80448026)
Co-Investigator(Kenkyū-buntansha)	寿野良二関西医科大学, 医学部, 講師 (60447521) 片野泰代関西医科大学, 医学部, 准教授 (60469244)
Project Period (FY)	2019-04-01 – 2023-03-31
Keywords	内臓痛
Outline of Annual Research Achievements	昨年度までにデキストラン硫酸ナトリウム飲水投与による潰瘍性大腸炎モデルマウスを用い、その疼痛応答行動と脊髄後角での神経活動の亢進（c-fos免疫染色）を確認した。さらに脊髄後角におけるc-fos陽性ニューロン中のPOU4f1陽性ニューロンの割合が非常に高いことを明らかにした。以上の結果より、内臓痛の伝達にはPOU4f1陽性ニューロンが深く関わっていることが示唆された。今年度はPOU4f1陽性ニューロンの内臓痛伝達における関与を検証するために、その機能阻害条件下での内臓痛応答の有無について検討した。まず、POU4f1-Creマウスの脊髄に興奮性DREADD遺伝子をコードするアデノ随伴ウイルス（AAV-flox-M3Dq-mCherry）を感染後、DREADDのアゴニストを投与し、POU4f1陽性ニューロンの誘導活性化による疼痛行動の誘導が可能であることを確認した。次に、POU4f1-Creマウスの脊髄に抑制性DREADD遺伝子をコードするアデノ随伴ウイルス（AAV-flox-M4Di-mCherry）を感染させ、抑制性DREADDをPOU4f1陽性ニューロン特異的に発現させる系を構築した。現在はそのマウスにおいて上記潰瘍性大腸炎モデルを作成し、抑制性DREADDのアゴニスト投与の有無における内臓痛応答行動の変化についての予備実験を行っている。また、POU4f1-Creマウスにジフテリア毒素受容体遺伝子を発現させるアデノ随伴ウイルス（AAV-flox-DTR-EGFP）の発現系についても予備実験を行っていて、POU4f1陽性ニューロンの欠失が可能かどうかの検討も行っている。
Current Status of Research Progress	Current Status of Research Progress 3: Progress in research has been slightly delayed. Reason アデノ随伴ウイルス、POU4f1-Creマウスを利用した、POU4f1陽性脊髄後角ニューロン特異的な遺伝子発現系は今年度に確立した。しかし、研究代表者の体調不良（手術、入院）により、その後の研究の進展（機能解析の実験）が遅れている。
Strategy for Future Research Activity	今年度に検討しきれなかった、POU4f1陽性ニューロンの機能阻害実験についてさらに研究を推し進める予定である。POU4f1陽性ニューロン特異的な機能阻害の有無において、内臓痛応答行動がどのように変化するかについて調べる。まず、抑制性DREADDをPOU4f1陽性ニューロンに発現させたマウスで潰瘍性大腸炎モデルマウスを作成する。さらに、抑制性DREADDのアゴニストを投与した際の内臓痛応答行動を解析し、投与前に比べて減少したかどうかについて調べる。さらに、POU4f1陽性ニューロンにジフテリア毒素受容体を発現させたマウスを用いて、これらニューロンを欠失させた条件下での機能阻害も試みる。まずこのマウスにジフテリア毒素を腹腔内投与することでニューロンの欠失を確かめる。次に、POU4f1陽性ニューロン欠失マウスにおける内臓痛応答を上記と同様に調べる。
Causes of Carryover	昨年度は研究代表者の体調不良により研究計画が予定通り進まなかった。次年度は、POU4f1陽性ニューロンの機能阻害における内臓痛応答行動の有無について検証する実験を行う。POU4f1-Creマウスの脊髄に抑制性DREADD（AAV-flox-M4Di-mCherry）、またはジフテリア毒素受容体（AAV-flox-DTR-EGFP）を発現させるアドの随伴ウイルスを注入し、それぞれPOU4f1陽性ニューロンの機能阻害、細胞欠失させた際に内臓痛応答行動を調べる。次年度使用額は、アデノ随伴ウイルスの購入、内臓痛モデル作成のためのデキストラン硫酸ナトリウム購入等に使用する予定である。