Analysis of extracellular matrix aging in the pathogenesis of TTR amyloidosis

2020 Fiscal Year Research-status Report

• Project/Area Number: 19K07869
• Research Institution: Kumamoto University
• Principal Investigator: 三隅 洋平 熊本大学, 病院, 講師 (80625781)
• Co-Investigator(Kenkyū-buntansha): 井上 泰輝 熊本大学, 大学院生命科学研究部(医), 特任助教 (00806408) ; 増田 曜章 熊本大学, 病院, 助教 (50464459) ; 植田 光晴 熊本大学, 病院, 教授 (60452885) ; 山下 太郎 熊本大学, 病院, 非常勤診療医師 (90381003)
• Project Period (FY): 2019-04-01 – 2022-03-31
• Keywords: アミロイド / トランスサイレチン / 線維芽細胞 / 細胞外マトリックス / 細胞老化 / 組織老化

Outline of Annual Research Achievements

細胞外マトリックスおよび線維芽細胞の老化によるトランスサイレチン分解除去能、アミロイド形成阻止能の変化をin vivoで明らかにするために、ヒトトランスサイレチン蛋白を発現するトランスジェニックマウスおよび野生型マウスの皮下に遺伝性トランスサイレチンアミロイド―シス患者から抽出したアミロイド線維の投与を行い、経時的に回収し、組織学的および生化学的解析を行った。老化マウスおよびコントロールマウス皮下にアミロイド線維を投与すると線維芽細胞が細胞内に取り込まれ、経時的にコンゴレッド染色陽性のアミロイドが減少していることが示唆された。電子顕微鏡観察では、アミロイド線維は線維芽細胞の細胞質内に多量に取り込まれ、細胞内小器官の著明な減少が認められた。
In vitroでの解析では、生体内の細胞外マトリックスを模したコラーゲンゲルおよび線維芽細胞株による三次元培養系において、未変性あるいは非アミロイド性凝集体化させたトランスサイレチン（野生型およびＶ30M変異型）、生理的条件でアミロイドを形成する断片化トランスサイ-チンペプチド（TTR81-127）、患者剖検組織より抽出したアミロイド線維を培養線維芽細胞に添加し電子顕微鏡観察、共焦点顕微鏡観察により、凝集体化させたトランスサイレチンおよび断片化トランスサイレチンが線維芽細胞内部に多量に取り込まれる像が認められた。また線維芽細胞の各種マーカーとの二重免疫染色では、アミロイドとリソソームマーカーの一部の共局在、細胞内小器官の著明な変化が認められた。

Current Status of Research Progress

2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.

Reason

In vitroおよびin vivoにおいて細胞外マトリックスにおける線維芽細胞のアミロイドの取り込みおよび分解除去機構を解析するためのモデルが作成し、未変性あるいは非アミロイド性凝集体化させたトランスサイレチン（野生型およびＶ30M変異型）、生理的条件でアミロイドを形成する断片化トランスサイレチン（TTR81-127）、患者剖検組織より抽出したアミロイド線維添加による線維芽細胞の形質変化およびトランスサイレチン分解除去能についての評価系については概ね計画通りに進捗している。
種々の方法により細胞外マトリックスおよび線維芽細胞の老化を誘導しているが、安定的に老化誘導ができるように更に方法の改善点についての検討を進めている。

Strategy for Future Research Activity

細胞外マトリックスおよび線維芽細胞の老化によるトランスサイレチン沈着および分解能の変化についての研究を推進する。まず、ヒト異型トランスサイレチン（TTR V30M）を発現するトランスジェニックモデルマウスおよび野生型マウスに対して光老化誘導、皮下への最終糖化産物（AGEｓ）の投与による老化誘導を行い、トランスサイレチン沈着量を解析する。さらに、トランスサイレチンアミロイドーシス患者組織より抽出したアミロイド線維を注入後、経時的に皮膚組織を回収し、アミロイドのクリアランス速度の違いを解析する。

Causes of Carryover

トランスジェニックマウスの老化誘導後のin vivo実験の一部を次年度に計画したため、次年度使用額が生じた。