糖尿病患者の骨粗鬆症に対する間葉系幹細胞治療とサイトアフェレーシス併用療法の開発

2019 Fiscal Year Research-status Report

• Project/Area Number: 19K07870
• Research Institution: Sapporo Medical University
• Principal Investigator: 永石 歓和 札幌医科大学, 医学部, 准教授 (30544118)
• Co-Investigator(Kenkyū-buntansha): 射場 浩介 札幌医科大学, 医学部, 准教授 (60363686)
• Project Period (FY): 2019-04-01 – 2022-03-31
• Keywords: 骨髄間葉系幹細胞 / 骨粗鬆症

Outline of Annual Research Achievements

令和元年度は、先ずストレプトゾトシン誘導１型糖尿病モデルラット(STZ rat)およびOLETF２型糖尿病モデルラット(OLETF rat)を作成し、マイクロCT解析による骨密度評価、および病理組織学的評価を行った。STZ ratは、病態誘導の早期から骨形成能および骨吸収能に関連する因子の低下が著しい一方、OLETF ratは月齢10カ月まではコントロール群と比較して骨皮質の菲薄化が少なく、骨量の低下は明らかでなかった。そこで、今年度は主にSTZ ratモデルを用いた解析を実施した。
STZ ratにおいて、非致死的放射線症照射を行った後に、蛍光標識した正常コントロールラット由来MSCを脛骨近位部、腸骨稜に骨髄内投与したところ、投与細胞は投与３日目、７日目まで局所で明瞭に検出されたが、14日目では殆ど検出されなかった。病理組織学的所見から、骨皮質については明らかな変化が見られなかったが、海綿骨における骨梁の増加傾向が見られた。椎体への投与は、部位を特定することが困難で、次年度に引き続き投与法の工夫を行うこととした。投与細胞の骨組織内における検出期間が想定よりも短期間であったことから、移植細胞に対する拒絶反応が一つの要因と考えられた。前処置としての放射線照射量の最適化、および化学療法剤の併用の検討が必要と思われた。
また、コントロールラットおよびSTZ ratにおける体外循環法を確立し、白血球除去ビーズを内含したカラムを用いたサイトアフェレーシスを行った。コントロールラットは安定的に体外循環を実施できたが、STZ ratは体重減少、および血液の凝固傾向が強く、電子顕微鏡観察下におけるビーズへの血球細胞の付着量および細胞種も想定より少ない傾向であった。骨密度が有意に減少するSTZ４－８週で安定的に実施することが困難であったため、今後より軽症モデルでの追加検討を行う予定である。

Current Status of Research Progress

3: Progress in research has been slightly delayed.

Reason

糖尿病モデル動物の骨髄内へのMSCの細胞投与およびサイトアフェレーシス療法の介入は、予定通りに実施した。
骨髄内MSC投与動物の骨組織について、その局在や細胞の検出期間、骨皮質・骨梁の組織学的変化、マイクロCTによる骨密度解析を実施した。前処置としての放射線照射量について、増量による皮膚障害の出現等があり、年度内に最適化することが困難であった。前処置は、移植した細胞に対する拒絶反応や細胞治療の効果に影響を与えることから必須の検討項目と考えらるが、これらの検討に想定以上の時間を要した。
また、サイトアフェレーシスについて、正常ラットでは安定的に実施可能であったが、STZ ratの病態モデルにおける体外循環が安定化せず、各種条件変更の検討に時間を要することから、プロトコールの確立が遅れている。これに伴い、STZ ratにおけるサイトアフェレーシスによる炎症制御効果の評価が不十分であることから、進捗は予定よりもやや遅れている。

Strategy for Future Research Activity

MSCの骨髄内投与およびサイトアフェレーシスによる全身の炎症制御効果について、先ず各々の優位性およびその機序について明らかにする必要がある。これを達成するために、各々の介入時期を再検討する。すなわち、糖尿病モデル動物（STZ rat）において有意に骨密度低下を認める進行期を標的とした治療的投与や介入に限定せず、より早期の軽症モデルに対する予防的治療・介入を含めた検討を行う。これにより、骨髄内移植およびサイトアフェレーシスの有用性とその想定される機序を明らかにする。
また、２型糖尿病モデル（OLETF rat）について、病態形成には長期間を要するが、末梢血中の炎症性サイトカイン量や白血球増加が明らかであることから、サイトアフェレーシス療法の成否を評価する上でSTZ ratよりも有用である可能性が見いだされた。そこで、OLETF ratを併用して各種解析を進めることで、研究を加速する。
さらにサイトアフェレーシス療法について、これまで主な指標としてきた末梢血CBC・白血球分画、白血球細胞におけるサイトカイン産生の解析に加えて、活性化血小板数 ・ナイーブな骨髄細胞の動員効率、骨組織における炎症性・抗炎症性サイトカインの測定、マクロファージ形質等について評価項目を拡大する。これらの機序解析を行うことで、広範に介入効果の有無および優位性を明らかにする。

Causes of Carryover

モデル動物の作製および各種試薬の購入にあたり、目的を等しくする他の研究助成金を使用して作製したモデル動物および試薬を共有することが可能であったことから、動物購入費用および物品購入費用が当初の予定よりも大幅に減少した。また、２型糖尿病モデル動物を用いた解析を次年度に繰り越したことから、高単価な動物の購入費用が減少した。また、骨組織の受託解析に供することが可能な（骨折・骨欠損のない）検体数が減少し、解析費用が減少した。
さらに、サイトアフェレーシスに使用するマイクロインジェクターについて、購入ではなく借用することで使用可能であったため、購入費経費が不要となった。これらの理由で、次年度使用額が発生した。
次年度については、２型糖尿病モデルラットを主たるモデルとして導入することから、動物単価が高額となり、動物購入費用として本年度の繰り越し分を使用する。また、各種骨髄細胞の分画および解析を目的としたフローサイトメトリー用抗体、磁気ビーズを用いた分取関連装置、表面抗原・細胞内サイトカインの多種類同時解析、免疫染色用抗体サイトカイン発現の解析用試薬の購入、骨組織のマイクロCT解析等に、次年度分の研究費を使用予定である。