2020 Fiscal Year Research-status Report
甲状腺疾患の病因解明に向けた濾胞内Tgによる濾胞機能調節シグナル伝達経路の同定
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19K07875
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| Research Institution | Teikyo University |
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Principal Investigator |
鈴木 幸一 帝京大学, 医療技術学部, 教授 (20206478)
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| Co-Investigator(Kenkyū-buntansha) |
山中 大介 東京大学, 大学院農学生命科学研究科(農学部), 特任助教 (10553266)
川島 晃 帝京大学, 医療技術学部, 研究員 (60624913)
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| Project Period (FY) |
2019-04-01 – 2022-03-31
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| Keywords | 甲状腺 / サイログロブリン / 細胞内シグナル伝達 |
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| Outline of Annual Research Achievements |
我々は、甲状腺濾胞内に貯蔵される甲状腺ホルモン前駆体であるサイログロブリン（Tg）が甲状腺刺激ホルモン（TSH）によって誘導される甲状腺機能遺伝子を転写レベルで制御する強力な生理活性物質であることを明らかにしてきた。しかしTgがどのように甲状腺細胞に作用しているか未だ不明である。前年度までに、TgはRaf/MEK/ERK経路、およびPI3K/Akt経路を活性化することを明らかにしてきた。本年度はそれらシグナル経路の阻害剤やsiRNAを用いたTgの甲状腺特異的遺伝子の発現抑制効果に対する解析と、未解明の細胞内シグナル伝達経路についての検討を行った。
まずRaf/MEK/ERK経路の解析を行うため、ERK1, 2のsiRNAをそれぞれ設計して各ERK またはその両方をknockdownしたラット甲状腺FRTL-5細胞を作製し、Tgの作用が阻害されるか甲状腺機能遺伝子の発現量で評価した。その結果ERKシグナルを抑制してもTgの効果は阻害されなかった。一方PI3K/Akt経路を解析するため、PI3Kの阻害剤であるLY294002を用いて同様の解析を行ったところ、Tgの効果が阻害されることが明らかとなった。故にTgの遺伝子発現抑制作用はPI3K/Akt経路を利用している可能性が示唆された。
Tgの細胞内シグナル伝達経路に関わるタンパク質の解析を行うため、通常培地にTgを添加したFRTL-5細胞からタンパク質を精製し、質量分析によってTgでリン酸化されるタンパク質を網羅的に解析した。その結果全体で2,448タンパク質、8,180リン酸化ペプチドが同定され、同定されたリン酸化部位は7,602箇所であった。また得られたリン酸化タンパク質をエンリッチメント解析し、Tgシグナルの候補を推測した。その結果Tgはインスリンや神経栄養因子の受容体シグナル因子のリン酸化を誘導することが明らかとなった。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
当初の計画通り、既知の細胞内シグナル伝達経路への影響、特にRaf/MEK/ERK経路とPI3K/Akt経路について、siRNAおよび阻害剤を用いてTgの甲状腺特異的遺伝子発現抑制効果に対する影響を解析し、Tgの細胞内シグナル伝達経路の機能評価に取り組むことができた。また質量分析を用いてTgが誘導するリン酸化タンパク質の網羅的な解析を行い、Tgの関与する細胞内シグナル因子の同定に進むことができ、研究はおおむね順調に進展していると考えられる。
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| Strategy for Future Research Activity |
前年度の検討により、TgのTSH作用抑制効果はPI3K-Akt経路を利用していることが示唆され、PI3K阻害剤を用いた検討からも、甲状腺機能遺伝子の発現に関わる重要なシグナル経路であると考えられる。
そこで次年度は、質量分析の結果からPI3K/Akt経路に関係するリン酸化タンパク質をより詳細に解析する。PI3K/Akt経路の解析だけでなく、質量分析によって検出されたリン酸化タンパク質について、スコアーが高いものや有力なパスウェイにあるものを中心として、さらにvalidationを行うことによって、Tgシグナルの全貌を明らかにする。最終的には、手術時に得られた甲状腺組織の病理組織切片や初代培養細胞を用いて、実際にヒトの甲状腺疾患においてそれらの経路の異常が見られるか解析を行う。
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| Causes of Carryover |
COVID-19の影響で渡航が出来なかったこともあり、使用計画の変更を行った。次年度は最終年度につき、計画通り使用完了できる見込みである。
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