2019 Fiscal Year Research-status Report
骨髄増殖性腫瘍におけるCALR変異に特異的な分子病態の解明と新規治療への応用
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19K07880
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| Research Institution | Kawasaki Medical School |
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Principal Investigator |
北中 明 川崎医科大学, 医学部, 教授 (70343308)
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| Co-Investigator(Kenkyū-buntansha) |
通山 薫 川崎医科大学, 医学部, 教授 (80227561)
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| Project Period (FY) |
2019-04-01 – 2022-03-31
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| Keywords | 骨髄増殖性腫瘍 / calreticulin / チロシンキナーゼ |
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| Outline of Annual Research Achievements |
骨髄増殖性腫瘍（MPN）は造血幹細胞の異常によって1系統以上の骨髄系細胞（顆粒球系、赤芽球系、巨核球系）が腫瘍性に増殖する疾患の総称である。MPNのうち、真性赤血球増加症（PV）、本態性血小板血症（ET）、原発性骨髄線維症（PMF）の3疾患は、1951年に米国のダムシェックによって提唱されたことおよび、その臨床的共通点から、古典的MPNとして扱われてきた。半世紀以上にわたって古典的MPN発症の分子メカニズムは不明であったが、2005年にPVの大多数、ETおよびPMFの約半数例でJAK2遺伝子の変異が見いだされ、続いてMPLの遺伝子変異が報告された。これらの変異は、サイトカインの刺激なしにサイトカイン受容体以降のシグナル伝達を恒常的に活性化し、細胞の自律増殖を引き起こすと考えられている。JAK2やMPL変異のないET、PMF症例の遺伝子異常は、その後も長らく不明であったが、2013年、大多数の症数でcalreticulin（CALR）遺伝子の変異が同定され、これによって引き起こされたフレームシフトに由来する新規のC末端を有する変異タンパクが産生されることがあきらかとなった。CALR変異は、JAK2やMPLの変異と相互に排他的であることからMPNの発症に深く関与すると想像されたが、CALR変異がMPNを発症させる機序は不明であった。これまでに我々および他のグループは、CALR遺伝子変異がサイトカインシグナル伝達系を活性化するためにはMPLの存在が必須であることをあきらかにした。本研究では、変異CALRがMPLシグナルを活性化するメカニズムについて、われわれが遺伝子編集技術を用いて作成したMPNのin vitroモデルであるCALR変異導入F-36P-MPL細胞株を対象として、細胞内情報伝達分子の機能を解析することによって重要な分子の同定を試みた。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
CALR変異は、JAK2やMPLの変異と相互に排他的であることからMPNの発症に深く関与すると想像されたが、MPNを発症させる機序は不明であった。CALR変異によるMPN発症機序の解析に適した既存の細胞株は存在せず、CALR変異を有するマウスはMPNの発症までに長期間を要することから、薬剤スクリーニングに適したin vitroモデルの開発が望まれていた。サイトカイン依存性ヒト細胞株F-36Pは、トロンボポエチン（TPO）受容体MPLを導入することによって、TPOによる増殖、巨核球系分化の観察が可能となる性質を有する。われわれはCRISPR-Cas9システムによる遺伝子編集技術を用いて、MPN疾患モデルであるCALR変異導入F-36P-MPL細胞株（CALRmut F-36P-MPL）を作成した。CALRmut F-36P-MPLを用いて変異CALR依存性の細胞増殖を阻害する化合物のスクリーニングを実施したところ、SRCファミリーチロシンキナーゼ（TKI）の選択的阻害剤であるPP2および、Bcr-Abl TKIならびにSrcファミリーTKIに対する選択性が高い阻害剤であるボスチニブによって変異CALR依存性の細胞増殖が有効に阻害されることが判明した。2つの阻害剤に共通した標的分子はSRCファミリーTKIであり、shRNAを用いた遺伝子のノックダウンによって、複数存在するSRCファミリーTKIのうち、変異CALR依存性細胞増殖に重要な分子の同定を試みた。LYNを標的とした2種類のshRNAをCALRmut F-36P-MPLに導入したところ、いずれのshRNAもサイトカイン非存在下に認められる変異CALR依存性細胞増殖を阻害した。このことから、Lynが変異CALR依存性細胞増殖に重要な分子である可能性が見出された。
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| Strategy for Future Research Activity |
CALR変異はMPN発症のドライバー変異として機能するが、昨年度までの本研究によって、Lynが変異CALR依存性の細胞増殖に重要な分子であることが示唆されている。われわれおよび他のグループは、エリスロポエチン受容体の刺激下で、SrcファミリーTKI（SRCおよびLYN）がJAK2とともにSTAT5などの活性化をもたらすことを報告しているが、MPLの下流においても同様のメカニズムが存在するのか否かについては不明である。CALRmut F-36P-MPLを用いた解析で得られたデータは細胞増殖におけるSrcファミリーTKI Lynの重要性を示しているが、変異CALRによるLynの活性化機序、およびLynがいかなるメカニズムで細胞増殖をもたらすのかについては明らかではない。次年度以降は、変異CALRとSrcファミリーTKIの関連について、さらに詳細な解析を実施する。今回のスクリーニングで抽出された薬剤の一つであるボスチニブは、慢性骨髄性白血病（CML）の治療薬として臨床の場で広く用いられている。ボスチニブはヒトの体内で到達可能な血中濃度でSrcファミリーTKIを有効に阻害することから、今回の知見を基盤とした臨床応用へのハードルが比較的低いと考えられる。これまでに記載したin vitroシステムによる解析で有望な結果が得られた場合は、変異CALRトランスジェニックマウスを用いたin vivoモデルの解析に移行する予定である。
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| Causes of Carryover |
購入を予定していたヒト細胞の培養に用いるサイトカンの購入費が少なく済んだため。また、コロナウイルス感染対策を目的とした出張の抑制によって2019年度末の旅費が不要となった。
次年度は、変異CALR機能の解析を目的とした網羅的遺伝子発現解析への支出を予定している。また、国内の学会参加費も支出予定である。
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Research Products
(9 results)
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[Journal Article] Clinical significance of soluble CADM1 as a novel marker for adult T-cell leukemia/lymphoma2020
Author(s)
Nakahata S, Syahrul C, Nakatake A, Sakamoto K, Yoshihama M, Nishikata I, Ukai Y, Matsuura T, Kameda T, Shide K, Kubuki Y, Hidaka T, Kitanaka A, Ito A, Takemoto S, Nakano N, Saito M, Iwanaga M, Sagara Y, Mochida K, Amano M, Maeda K, Sueoka E, Okayama A, Utsunomiya A, Shimoda K, Watanabe T, Morishita K
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Journal Title
Haematologica
Volume: 106
Pages: 532～542
Peer Reviewed
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[Journal Article] Binimetinib, a novel MEK1/2 inhibitor, exerts anti-leukemic effects under inactive status of PI3Kinase/Akt pathway.2019
Author(s)
Sakakibara K, Tsujioka T, Kida JI, Kurozumi N, Nakahara T, Suemori SI, Kitanaka A, Arao Y, Tohyama K
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Journal Title
International journal of hematology
Volume: 110
Pages: 213-227
DOI
Peer Reviewed / Int'l Joint Research
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