2019 Fiscal Year Research-status Report
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19K07883
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| Research Institution | Tokyo Metropolitan Geriatric Hospital and Institute of Gerontology |
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Principal Investigator |
萬谷 啓子 地方独立行政法人東京都健康長寿医療センター(東京都健康長寿医療センター研究所), 東京都健康長寿医療センター研究所, 研究員 (70415496)
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| Project Period (FY) |
2019-04-01 – 2022-03-31
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| Keywords | アルツハイマー病 / APP / 糖鎖 |
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| Outline of Annual Research Achievements |
近年糖鎖の異常が様々な疾患の原因となることが示されており、タンパク質の機能を考える上で糖鎖修飾まで含めた解析を行う事が必要である。研究代表者はこれまでにアルツハイマー病（AD）患者脳では健常脳と比較してO型糖鎖合成開始酵素ファミリーppGalNAcTの発現が異なることや、APP上のO型糖鎖の変化によって代謝が変動し、βアミロイド（Aβ）産生に影響することを見いだしている。そこで本研究では、APPはppGalNAcTによってどのようにO型糖鎖修飾されるのか、O型糖鎖修飾はAPP代謝へどのような影響をおよぼすのかを明らかにすることを目的とする。ppGalNAcTは約20個のアイソフォームが同定されているが、それぞれの基質特異性は完全には解析されていない。そこで、共発現によりAβ産生を減少させる効果の見られたppGalNAcT6について研究を行っている。
今年度は、APP代謝における糖鎖変化の影響や糖鎖修飾部位の解析を行うため、培養細胞を用いてAPPの大量発現および精製を行った。ppGalNAcT6の共発現あり、なしの各条件下で培養細胞を用いてAPPを発現させ、培養上清からsAPPを精製した。同様の方法でO型糖鎖修飾部位と考えられるアミノ酸を置換したAPPを発現させ、sAPPを精製した。これを用いてMSによりO型糖鎖修飾部位の解析を進めている。また、ppGalNAcT6欠損細胞でAPPを発現する細胞株を作成中である。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
3: Progress in research has been slightly delayed.
Reason
リコンビナントAPPを発現する細胞株を作成したが、安定発現細胞株の取得と大量培養に予想より時間を要したため、当初の実験計画よりやや遅れていると判断した。
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| Strategy for Future Research Activity |
前年度に引き続き、リコンビナントAPPを用いてO型糖鎖修飾部位の解析を行う。同時に糖鎖構造解析を行う。また、精製したAPPのin vitroにおける各セクレターゼに対する感受性を調べる。さらに、糖鎖修飾の異なるAPPと各セクレターゼの細胞内局在を免疫染色により調べ、各分子の局在変化がAβ産生変化をもたらすか検討する。Icelandic変異型APPでは置換されたThrが新たなO型糖鎖修飾部位となっている可能性が考えられるので、この変異型APPにおける糖鎖修飾を解析する。糖鎖修飾の変化が認められた場合は、同様に各セクレターゼに対する感受性や細胞内局在を調べる。
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| Causes of Carryover |
当初の計画よりも物品費を安く抑えることができたため未使用額が発生したが，次年度以降の物品購入に使用予定である
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