mGluR5異所性発現による神経変性疾患発症メカニズムの解明

2019 Fiscal Year Research-status Report

• Project/Area Number: 19K07971
• Research Institution: The University of Tokyo
• Principal Investigator: 中尾 晴美 東京大学, 大学院医学系研究科(医学部), 特任助教 (50535424)
• Project Period (FY): 2019-04-01 – 2024-03-31
• Keywords: mGluR5 / GRM5 / cerebellum / transgenic / mouse / L7 / mGluR1 / neurodegeneration

Outline of Annual Research Achievements

本研究の目的は、本来、成体マウスの小脳でほとんど発現していない代謝型グルタミン酸受容体（metabotropic glutamate receptor 5: mGluR5）を異所的に強制発現することによって、神経変性が生じるかどうかを確認し、そのメカニズムについて明らかにすることである。
神経変性疾患は高齢化社会の抱えている大きな問題であり、予防法・治療法の開発のためにその発症メカニズムの解明が求められている。我々は、マウスの小脳プルキンエ細胞において、発生の初期にはmGluR5が多く発現しているが、mGluR5と同じグループIのmGluR1の発現量が増加する生後16日頃までに、mGluR5の発現量は減少していくこと、さらに、成熟マウスのプルキンエ細胞でmGluR1の発現を抑制すると、mGluR5の発現が亢進することを報告している。mGluR1とmGluR5は同じ細胞内シグナル伝達経路を活性化するが、発現時期および発現場所が異なっている理由は未だ明らかとなっていない。また、mGluR5の発現が、神経変性疾患患者の小脳で亢進していることも報告されている。
本年度はまず、小脳プルキンエ細胞特異的にmGluR5を発現するようなトランスジェニックマウスの作製のため、L7 プロモーター下に直接rat mGluR5 cDNAを配置したベクターを構築し、マウス受精卵へのマイクロインジェクションにより、７匹のファウンダーマウスを得た。現在4匹のファウンダーマウスからF1マウスを得ている。また、目的のマウスが胎生致死などで得られない場合を考え、すでに作製済みのL7-tTA トランスジェニックマウスと交配して、ドキシサイクリンの投与により、mGluR5の発現をコントロールできるようなマウスを得るため、TRE-mGluR5 トランスジェニックマウスの作製にも着手している。

Current Status of Research Progress

2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.

Reason

本年度は計画通り、小脳プルキンエ細胞特異的にmGluR5を発現するようなトランスジェニックマウスの作製に着手し、7匹のファウンダーマウスを得て、さらに4匹からF1マウスを得ている。トランスジェニックマウスのライン化のため、サザンブロット解析用のプローブを設計し、野生型マウスのゲノムDNAおよびベクターDNAを用いて、最適なプローブと制限酵素を決定した。mGluR5の発現確認のために抗体を複数購入し、野生型マウスの脳サンプルを用いて、ウェスタンブロット解析や免疫染色を行い、今後の解析に最適なものを選別した。従って、概ね順調に進展していると評価した。

Strategy for Future Research Activity

今後は、得られたファウンダーマウスとF1マウスから尻尾DNAを抽出し、サザンブロット解析によりライン化を行い、ウェスタンブロット解析 や免疫染色により、発現量および発現パターンの確認を行う。
同時に、mGuR1 ノックアウトマウスは運動失調を示し、小脳プルキンエ細胞にmGluR1を発現させることにより、その運動失調は回復するが、本研究で得られたL7-mGluR5トランスジェニックマウスにmGluR1 ノックアウトを交配により導入し、小脳プルキンエ細胞特異的にmGluR5を強制発現させた時に、mGluR1同様に運動失調が回復するかどうかも確認する。回復するような系統が得られれば、今後の解析に使用する。mGluR5の発現が見られるにも関わらず、運動失調が回復しないようであれば、単純に発現量の多いものからその後の解析に必要な系統を選別する。また、目的のマウスが胎生致死などで得られない場合を考え、ドキシサイクリンの投与により、mGluR5の発現をコントロールできるようなマウスを得るため、TRE-mGluR5 トランスジェニックマウスの作製を行い、すでに作製済みのL7-tTA トランスジェニックマウスと交配する。