2020 Fiscal Year Research-status Report
mGluR5異所性発現による神経変性疾患発症メカニズムの解明
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19K07971
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| Research Institution | The University of Tokyo |
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Principal Investigator |
中尾 晴美 東京大学, 大学院医学系研究科(医学部), 特任助教 (50535424)
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| Project Period (FY) |
2019-04-01 – 2024-03-31
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| Keywords | 代謝型グルタミン酸受容体 / mGluR5 / mGluR1 / トランスジェニックマウス / 小脳 / レスキュー / 神経変性 / シグナル伝達 |
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| Outline of Annual Research Achievements |
代謝型グルタミン酸受容体であるmGluR1とmGluR5は、中枢神経系において、空間的あるいは時期的に相互排他的な発現を示す傾向がある。特に小脳では、mGluR5の発現量が発達期から成熟期へ向けて減少し、それとは対照的にmGluR1の発現量は発達期から成熟期へ向けて増加していく。脊髄小脳変性症（SCA1）のモデルマウスでは、成体の小脳プルキンエ細胞において、mGluR1の発現量が減少するとともに、mGluR5の発現量が増加していることが報告されている。本研究では、成体マウスの小脳にmGluR5を強制発現させることによって、mGluR5の異所性発現がシグナル伝達にどの様な影響を及ぼし、病態に結びついていくのかを明らかにしていく。
昨年度までに、小脳プルキンエ細胞特異的なL7遺伝子のエクソン4にrat mGluR5 cDNAを導入したトランスジェニックマウス(L7-mGluR5 Tg)のファウンダー（Fo）を7匹得ていた。本年度は、これらのFoマウスからF1マウスを取得し、サザンブロット解析によるライン化、免疫染色によるmGluR5の発現パターンの確認、およびウェスタンブロット による発現量の確認を行なった。また、mGluR1欠損マウス(mGluR1 KO)とL7-mGluR5 Tgマウスを交配することにより、mGluR1 KOマウスで見られる小脳運動失調が改善されるかを検討し、3ラインで運動失調の改善を確認した。これらの結果は、機能的なmGluR5が十分発現していることを示しているとともに、運動協調においてはmGluR5がmGluR1の機能を代替できることを示している。一方で、mGluR1/5の足場タンパク質であるHomerとの相互作用に、mGluR1とmGluR5の間で差が見られ、両者の間にシグナル伝達効率の違いがあることが示唆された
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
本年度は、昨年度までに得られていたL7-mGluR5 Tgの7匹のFoマウスのうち、5匹からF1マウスが得られた。Fo、F1マウスの尻尾から抽出したDNAを用いたサザンブロット解析により、トランスジーンの挿入パターンを確認し、5ラインのL7-mGluR5 Tgを樹立した。これらのマウスのmGluR5の発現パターンや発現量を、免疫染色やウェスタンブロットにより確認した。免疫染色の結果、L7-mGluR5 Tgでは小脳皮質の分子層にmGluR5の発現が見られ、calbindin抗体との二重染色により、プルキンエ細胞でmGluR5が発現していることが確認された。ウェスタンブロットにより、各ラインのL7-mGluR5 Tgマウスの小脳でのmGluR5の発現量を確認した。これらのマウスを、小脳運動失調を示すmGluR1 KOマウスと交配し、トランスジーンによるmGluR5の発現により、この運動失調が改善するかどうかを検証した。ロータロッド試験やフットプリント試験を行った結果、運動失調の改善が認められ、小脳の運動協調にはmGluR5がmGluR1を代替できることが明らかとなった。この結果より、L7-mGluR5 Tgは、十分な量の機能的なmGluR5を発現していることがわかった。一方で、mGluR1/5の足場タンパク質であるHomerはmGluR1やmGluR5と相互作用するが、共免疫沈降により、mGluR1と相互作用するHomerに比べ、mGluR5に結合するHomerの量が少ないことがわかった。これにより、mGluR1とmGluR5ではシグナル伝達効率に違いがあることが示唆された。
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| Strategy for Future Research Activity |
L7-mGluR5 Tgを導入したmGluR1 KOマウスでは、mGluR1 KOマウスで見られる重度の運動失調が改善し、野生型マウスと同程度の運動協調が確認された。このため、このラインはプルキンエ細胞でのmGluR5の発現量は十分であると考えられる。今後は、小脳運動失調以外のmGluR1 KOマウスで見られる表現型についても、同様に改善が見られるかを確認するとともに、改善の度合いが異なる複数ラインが得られていることから、それぞれについて、行動異常や神経変性などの異常が見られるかどうかを確認する
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| Causes of Carryover |
新型コロナウイルス感染症の影響で実験が滞った期間があったため。
本年度できなかった、小脳運動失調以外のmGluR1 KOマウスで見られる表現型についても、mGluR5トランスジーン によって、同様に改善が見られるかを確認する
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