2019 Fiscal Year Research-status Report
ヒト脳オルガノイドを用いた神経変性疾患を引き起こすリピート病の病態解析
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19K07978
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| Research Institution | Nara Medical University |
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Principal Investigator |
桐山 敬生 奈良県立医科大学, 医学部, 講師 (80571025)
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| Co-Investigator(Kenkyū-buntansha) |
杉江 和馬 奈良県立医科大学, 医学部, 教授 (60347549)
松井 健 奈良県立医科大学, 医学部, 助教 (90528605)
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| Project Period (FY) |
2019-04-01 – 2022-03-31
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| Keywords | 脳オルガノイド / 脳幹オルガノイド / ALS / 脊髄小脳変性症 / C9orf72 / FUS / ポリペプチド / laser micro-irradiation |
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| Outline of Annual Research Achievements |
本研究は脳オルガノイドの特性を解析するとともに、非翻訳領域のリピート病を中心にALSや脊髄小脳変性症などの神経変性疾患の分子病態メカニズムの解析研究を行っている。
ヒトiPS細胞からLancaster法と独自のプロトコールで脳オルガノイドを作製した。脳オルガノイドからメラニン含有細胞の存在と、脳幹への発生発達過程におけるneural crest cellに重要なSOX9の発現、中脳を含む前脳構造の発達に重要な神経幹/前駆細胞マーカーであるSOX2、ASCL1、SLC1A3、OTX2の発現、ドーパミン作動性ニューロンへの誘導に働くFOXA2の発現を免疫組織染色で確認し、脳幹細胞成分が多く発現していることを見出した。
C9orf72遺伝子の繰返し配列（(GGGGCC)n）異常を伴うALS/FTDの患者由来細胞では、RAN translationによって複数の細胞毒性ポリペプチドが産生され、核膜孔タンパク質のFG配列を持つLCドメインと結合し、核膜孔を塞ぎ、核・細胞質間の物質輸送を阻害すると考えられる。ALSの原因遺伝子であるFUSはN末領域にLCドメインを有し、毒性ポリペプチドとともにALSの発症に関与していると考え、繰り返し配列による毒性ポリペプチドがFUSのDNA修復機構に与える影響の解析を進めている。合成ポリペプチドを作製し、pEGFP-FUSを切断したlinear plasmidをU-2OS細胞にtransfectionし、選択的にpEGFP-FUSが発現する株を作製し、共焦点顕微鏡を用いたlaser micro-irradiation法により、pEGFP-FUSの発現した細胞の核内にDNA損傷（double strand break）を起こした。幾つかの条件下で経時的なpEGFP-FUSのDNA損傷部位への集積の変化を捉えることができた。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
当大学の倫理委員会への申請承認を得て、理化学研究所のCELL BANKの協力のもと、ヒトiPS細胞から脳オルガノイドの樹立、その特性の評価をおこなった。現在健常者由来のiPS細胞からの脳オルガノイドは解析を終え、脳幹オルガノイドとしての特性を明らかにした。患者由来iPS細胞からの脳オルガノイドも作製する予定で、患者iPS細胞樹立、品質評価に時間がかかっているが、先に非翻訳領域の繰り返し配列から作られる毒性ポリペプチドを合成することで、ALSの原因遺伝子の一つであるFUSとRAN翻訳により生じるポリペプチドの関係の解析を進めている。
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| Strategy for Future Research Activity |
非翻訳領域の繰り返し配列のある脊髄小脳変性症（SCA36）患者由来のiPS細胞の品質検査管理が終了次第、患者由来のiPS細胞から脳オルガノイドの作製し、病態解析を行う方針である。また、脳オルガノイドの特性をさらに調べるため、低酸素、低栄養状態（oxygen glucose deprivation）における変化をqPCR法や免疫組織染色を用いた解析を行う。また、毒性ポリペプチドの存在下でのFUSのDNA損傷修復異常や、PARPやFUSを含むRNA binding proteinによる修復蛋白の働きを調べ、さらに他のALS関連遺伝子TDP-43などとの関係を調べることで神経変性疾患の病態機序を明らかにしていく方針である。
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