2020 Fiscal Year Research-status Report
先進的ゲノム編集技術を用いた難治性神経筋疾患に対する治療戦略
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19K07981
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| Research Institution | Teikyo University |
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Principal Investigator |
斉藤 史明 帝京大学, 医学部, 准教授 (40286993)
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| Co-Investigator(Kenkyū-buntansha) |
真先 敏弘 帝京科学大学, 医学教育センター, 教授 (00585028)
萩原 宏毅 帝京科学大学, 医療科学部, 教授 (80276732)
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| Project Period (FY) |
2019-04-01 – 2022-03-31
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| Keywords | ゲノム編集 / CRISPR/Cas9 / 筋強直性ジストロフィー / アルツハイマー型認知症 |
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| Outline of Annual Research Achievements |
これまで原因が不明とされてきた神経変性疾患や遺伝性筋疾患の多くでその病態や遺伝子異常の詳細が明らかにされつつある。例えば筋強直性ジストロフィーをはじめとするリピート病では、異常伸長した３塩基リピート配列が凝集体を形成しこれが細胞に対して毒性を発揮する。またアルツハイマー病においてはアミロイド前駆体蛋白質（APP）からアミロイドβが切り出され毒性を有する可溶性オリゴマーが形成され、これが老人斑として凝集する過程において神経細胞を障害する。これら核酸やペプチドの“凝集病“においてはこの凝集を制御することが疾患治療にむけての明確な分子標的となる。
昨年度までの培養細胞を用いた研究で、筋強直性ジストロフィーのCTGリピート配列を挟むように配した2つのgRNAを用いてCRISPR/Cas9によるゲノム編集を行うとこのCTGリピートの除去ならびにRNA凝集体形成を抑制することが可能であることを示した。一方で同時にゲノム上の2カ所を切断することで予想外の非特異的切断が生じることも明らかとなった。そこで本年度はゲノム切断を伴わないより安全なCRISPR interference法を用いてRNA凝集体の形成抑制を試みた。この結果予想通り本法においてDMPKの転写が抑制されることを定量的PCR法により確認した。さらにRNA-FISH法によりmRNAの凝集を観察したところ凝集体形成が有意に抑制されることが明らかになった。
一方でアルツハイマー型認知症における蓄積ペプチドであるアミロイドβの産生を抑制するためにその前駆体蛋白質であるAPPに対するゲノム編集を開始した。Preliminaryではあるが、アミロイド前駆体蛋白質のExon 1を標的としてCRISPR/Cas9を作用させることでAPPの転写が有意に減少するとのデータが得られている。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
これまでの一連の研究により1) CRISPR/Cas9により筋強直性ジストロフィーにおけるCTGリピートの除去ならびにRNA凝集体形成の抑制が可能であること、2) しかしゲノム上の2カ所を切断することで予想外の非特異的切断が生じること、3)より安全なゲノム切断を伴わないCRISPR interference法によってもRNA凝集体形成の抑制が可能であることを示した。そしてこれらの結果を英文雑誌に原著論文として発表することができた。またアルツハイマー型認知症に関する研究もスタートし、APPに対するゲノム編集を行うことでAPPの転写を低減する道筋も開かれつつある。これらのことからおおむね順調に進展していると自己評価した。
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| Strategy for Future Research Activity |
次年度は研究の重点をアルツハイマー型認知症に移す。現在APPのExon 1を標的にしてゲノム編集実験を行っているがこの方法ではAPPの配列自体を改変することになる。そこで上流のプロモーター領域や3'非翻訳領域などAPPの転写を制御している部位を標的としてCRISPR/Cas9によるゲノム編集を行ってみる。これによりAPPの配列は変更せず転写のみを抑制することが可能かもしれない。また上述したCRISPR interference法によりAPPの転写を抑制することも試みる。そして培養上清中に放出されるアミロイドβをELISAによって定量することでこれらの中で最も効率の良い方法を探る。そして最終的にはモデルマウスを用いたin vivoの系でAAVベクターを用いてゲノム編集を行い、その有効性を検証したいと考えている。
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| Causes of Carryover |
本年度疾患モデルマウスを作製する予定であったが、既存のモデルマウスで代替できる可能性が出てきたため実施でしなかった。次年度使用が生じたのはこのための金額である。元々の次年度分と合わせてアルツハイマー型認知症などに対するゲノム編集を用いた治療法開発に関わる研究費に充てる予定である。
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[Journal Article] Unexpected mutations by CRISPR-Cas9 CTG repeat excision in myotonic dystrophy and use of CRISPR interference as an alternative approach.2020
Author(s)
Ikeda M, Taniguchi-Ikeda M, Kato T, Shinkai Y, Tanaka S, Hagiwara H, Sasaki N, Masaki T, Matsumura K, Sonoo M, Kurahashi H, Saito F.
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Journal Title
Mol Ther Methods Clin Dev
Volume: 18
Pages: 131-144
DOI
Peer Reviewed / Open Access
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