Identification of proteins associated with ATXN8OS-related amyotrophic lateral sclerosis and treatment of iPS cell models

2019 Fiscal Year Research-status Report

• Project/Area Number: 19K07984
• Research Institution: Kindai University
• Principal Investigator: 平野 牧人 近畿大学, 医学部, 准教授 (50347548)
• Co-Investigator(Kenkyū-buntansha): 竹原 俊幸 近畿大学, 大学病院, 助教 (60580561)
• Project Period (FY): 2019-04-01 – 2022-03-31
• Keywords: iPS細胞 / 運動ニューロン / ATXN8OS / SCA8 / ATXN8

Outline of Annual Research Achievements

本研究は、ATXN8OS関連ALSの病態に関連する蛋白の同定とiPS細胞由来の運動ニューロンモデルの構築と治療法開発を目指す。さらに、ブレインバンクから検体を提供いただき、病理組織も用いて結果を検証する。まず、病理的にALSと確認されている患者の遺伝子のスクリーニングを東京都健康長寿医療センター高齢者ブレインバンクと共同研究にて実施した。予定は最低30例であったが、49例提供していただき、全例で検査を施行した。その結果１例でATXN8OS変異陽性者が同定された。次にATXN8OS変異陽性患者の人工多能性幹 (iPS)細胞の樹立については、１例では既にiPS細胞の樹立は終了している。最近の研究でATXN8OS遺伝子変異陽性ALSがさらに２例同定された。その２症例の線維芽細胞を樹立し、現在iPS細胞を作製中である。また、既に樹立しているATXN8OS変異陽性患者のiPS細胞の運動ニューロンへの誘導を行い、運動ニューロンへ誘導することができ、現在、形態的、生化学的な性質を解析中である。さらに、iPS細胞由来運動ニューロンの染色とrepeat-associated non-AUG (RAN) 翻訳の確認を行っていくために、ポリセリンに続くアミノ酸配列、およびポリアラニンに対するポリクローナル抗体を作成し、ELISA標的抗原ペプチドへの反応は得られた。また、RAN翻訳にて生じるポリアミノ酸と関連する蛋白の同定のために、GFP融合の正常長ATXN8OSを発現するプラスミドベクターを構築した。iPS細胞由来運動ニューロンへの治療介入のため、３種類のsiRNAと３種類のアンチセンス核酸を設計・作製し、現在線維芽細胞において発現抑制が可能かの予備実験を行っている。

Current Status of Research Progress

2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.

Reason

一部、計画以上の検体の遺伝子スクリーニングをできている。また、治療実験も既に予備実験を開始しており、進捗は早い。他方、iPS細胞への分化に関しては、新しい患者検体が得られたので、それを優先して行っているため、少し遅れている。全体としては、おおむね順調と考えらえる。

Strategy for Future Research Activity

今年度の研究にて、世界に先駆けて病理学的確定のATXN8OS遺伝子陽性例が同定できたので、すでに、TDP43の蓄積などは、確認されている症例であるが、さらなる免疫組織学的解析を行うことが可能となった。また、２例の新規患者さんも同定され、本疾患が、さらに多く存在していることが分かった。今後、病気に関連する前頭葉におけるATXN8OS発現とそのアンチセンスになるATXN8発現を比較しながら、定量方法についてさらに検討を行い、発現の抑制が可能であるかを検討していく。また、ベクターを構築できたので、細胞実験で結合蛋白の同定を目指す。

Research Products

• [Journal Article] Effects of the rotigotine transdermal patch versus oral levodopa on swallowing in patients with Parkinson's disease (2019)
  • Author(s): Hirano M, Isono C, Fukuda K, Ueno S, Nakamura Y, Kusunoki S
  • Journal Title: J Neurol Sci Volume: - Pages: -
  • DOI: 10.1016/j.jns.2019.07.003
  • Peer Reviewed
• [Journal Article] Pathological Findings in Male Patients With Anti-N-methyl-d-Aspartate Receptor Encephalitis (2019)
  • Author(s): Hirano M1,2, Itoh T3, Fujimura H4, Inoue K4, Samukawa M1,2, Nose K5, Sakamoto H2, Maekura S6, Ueno S1,2, Satou T3, Nishioka T4, Kusunoki S, Nakamura Y
  • Journal Title: J Neuropathol Exp Neurol Volume: - Pages: -
  • DOI: 10.1093/jnen/nlz052
  • Peer Reviewed
• [Journal Article] 脊髄小脳変性症の遺伝子診断と近畿圏における病型 (2019)
  • Author(s): 仲間美奈、西郷和真、平野牧人、濱田征宏、金城ちなつ、寒川 真、長谷川隆典、北口正孝、三井良之、巽 順子、田村和朗、楠 進
  • Journal Title: 日本カウンセリング学会誌 Volume: 40 Pages: 95-100
  • DOI: -
  • Peer Reviewed
• [Presentation] NON-CODING REPEAT EXPANSIONS IN THE ATXN8OS GENE ARE IDENTIFIED IN JAPANESE PATIENTS WITH AMYOTROPHIC LATERAL SCLEROSIS. (2019)
  • Author(s): Makito Hirano, Makoto Samukawa, Chiharu Isono, Kazumasa Saigoh, Yusaku Nakamura, Susumu Kusunoki
  • Organizer: World Congress of Neurology 2019
  • Int'l Joint Research
• [Presentation] Clinical features and progression of dysphagia in bulbar-onset or limb-onset amyotrophic lateral sclerosis between patients with genetic mutations and those without mutations (2019)
  • Author(s): Chiharu Isono, Makito Hirano, Kanji Fukuda, Makoto Samukawa, Kazumasa Saigoh, Yusaku Nakamura, Susumu Kusunoki
  • Organizer: World Congress of Neurology 2019
  • Int'l Joint Research
• [Presentation] Non-coding repeats in the ATXN8OS gene are expanded in Japanese patients with amyotrophic lateral sclerosis (2019)
  • Author(s): Makito Hirano, Makoto Samukawa, Chiharu Isono, Kazumasa Saigoh, Yusaku Nakamura, Susumu Kusunoki
  • Organizer: 2019 Annual Meeting - American Academy of Neurology
  • Int'l Joint Research