2019 Fiscal Year Research-status Report
A novel model animal recapitulating ALS pathophysiology
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19K08006
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| Research Institution | National Center of Neurology and Psychiatry |
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Principal Investigator |
高橋 祐二 国立研究開発法人国立精神・神経医療研究センター, 病院, 部長 (00372392)
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| Project Period (FY) |
2019-04-01 – 2022-03-31
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| Keywords | 筋萎縮性側索硬化症 / ErbB4 / コンディショナルノックアウト / 運動ニューロン / 神経細胞死 |
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| Outline of Annual Research Achievements |
【目的】筋萎縮性側索硬化症（ALS）の病因遺伝子ERBB4の運動ニューロン(MN)特異的なノックアウトマウスを作成し、ErbB4の発現喪失がMN変性の直接原因であるという仮説をin vivoで検証する。【方法】ChAT-CreERTマウスとErbb4flox/floxマウスの掛け合わせにより、純系のタモキシフェン依存性MN特異的コンディショナルノックアウトマウス(ChATERT-cKOマウス)を作製する。行動解析・神経生理学的解析・病理学的解析を行い、孤発性ALSのモデル動物としての妥当性を検証する。既知のALSの病態仮説における分子マーカーの挙動を解析するとともに、新規のMN変性関連分子の探索を行う。【結果】B6系統に対してChATERT-cKOマウスのN8バッククロスを行い、純系を確立した。ChATERT-cKOマウスのN1世代を用い、ChATERT-cKOマウスにおける病理学的検討を行い、タモキシフェン投与後1ヶ月から3ヶ月にかけて脊髄前角MNが野生型の約半数にまで経時的に減少していること、残存MNはすべてErbB4陽性であることを見出した。一方、純系に対して予備的検討と同量のタモキシフェンを投与したが、死亡率の上昇が認められたため、至適量を再検討し、純系に対する投与を期間内に開始した。【考察】N1世代を用いた予備的検討により、病理学的にもMN変性が確認でき、モデル動物としての妥当性を裏付ける結果が得られた。一方、タモキシフェンの至適投与量の決定については、129系統と比べてB6系統はタモキシフェンに対する脆弱性がある可能性を考慮すべきであると考えられた。ただし研究期間内に純系に対する投与を行い当初の目標は達成した。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
期間内にChATERT-cKOマウスの純系を確立した。タモキシフェンの投与に関しては系統の違いによる脆弱性の差が原因と思われる死亡率の上昇という予期せぬ結果が生じ、至適投与量の再検討が必要であった分やや遅延が生じたが、最終的には純系ChATERT-cKOマウスに対する投与実験を開始したことから、当初の目標は達成できたと考えられる。また、N1世代マウスを用いた予備的検討においては、病理学的に経時的なMNの脱落を観察することができた。これまでの予備的検討において、進行性のClasping現象・後肢握力の低下等の運動ニューロン変性を示唆する表現型を認めていたが、今回の検討で表現型に対応してMN変性の病理学的所見を認めたことから、ChATERT-cKOマウスの孤発性ALSのモデル動物としての妥当性を裏付ける結果が得られたことは、期間内の特筆すべき進捗であった。
以上、期間内に順調に研究は進捗した。
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| Strategy for Future Research Activity |
① 純系ChATERT-cKOマウスの表現型・生理学・病理学的分析：a.行動解析 Clasping、Rotor rod、Grip strength、Cage activityなどの行動解析を行い、時系列の変化を明らかにする。Caplan-Meyer法による生存曲線を作成する。b.生理学的解析 針筋電図などの神経生理学的検査により、神経原性変化の検出を経時的に行う。c.病理学的解析 脊髄MNの変性を病理学的に検討する。TDP-43の局在異常、Bunina小体など、ALSの病理学的指標の出現の有無を検討する。
② 既知のALSの病態仮説における分子マーカーの分析：RNA代謝異常、オートファジー障害、ERストレス、核小体ストレス、興奮性神経毒性、軸索機能障害など、ALSの分子病態のマーカー分子の挙動を分析し、ChATERT-cKOマウスがこれらの病態を再現しているかどうかを検討する。
③ 新規MN変性関連分子の探索：ErbB4は癌遺伝子として知られているEGFRサブファミリーに属することから、細胞の増殖制御に関連していることが示唆される。本研究では、細胞増殖制御分子に着目し、ErbB4喪失によるMN変性過程における変化を免疫組織化学的に追跡することで、新たなMN変性関連分子を探索する。特に細胞周期チェックポイントであるp53およびCyclin-dependent kinase 関連タンパク質の時系列変化を追跡する。
以上、当初の予定通りに研究を遂行する。
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| Causes of Carryover |
コンディショナルノックアウトマウスを作成する際に129系統からB6系統へのバッククロスを行って純系を確立した。当初N1世代を用いた予備的検討によりタモキシフェンの至適投与量を設定していたが、B6純系になったことによりタモキシフェンに対する脆弱性が生じ、至適投与量の再検討が必要となった。その分当初予定されていた研究計画に遅延が生じ、次年度使用額が生じた。さらに、予備的検討を踏まえた結果を国際学会で発表することを予定していたが、研究の遅延により発表を見送ったため、旅費を使用しなかったことで次年度使用額が生じた。
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Research Products
(3 results)
