2019 Fiscal Year Research-status Report
放射線抵抗性口腔癌に対するヒアルロン酸産生阻害を応用した併用放射線治療の研究
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19K08141
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| Research Institution | Hirosaki University |
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Principal Investigator |
細川 洋一郎 弘前大学, 保健学研究科, 教授 (70173599)
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| Project Period (FY) |
2019-04-01 – 2022-03-31
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| Keywords | ヒアルロン酸 / 癌幹細胞 / 放射線抵抗性 / 口腔扁平上皮癌 / 放射線治療 |
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| Outline of Annual Research Achievements |
放射線抵抗性細胞は予後不良を引き起こし、その抵抗性細胞は癌幹細胞割合が高いという仮説に基づき、口腔扁平上皮癌細胞株のSAS、HSC2およびそれぞれの放射線抵抗性株であるSAS-R、HSC2-Rの放射線感受性および癌幹細胞割合について検証した。包括的な細胞死を評価するために0～10 GyのX線照射時の生存率をコロニー形成能により測定した結果、いずれの線量においても、放射線抵抗性細胞株で有意に生存率が上昇した。続いて、SASおよびSAS-Rに対し、X線照射から1～24時間後のアポトーシス細胞割合をフローサイトメトリー法により検証した結果、両細胞株ともに経時的にアポトーシスの割合が増加したが、SAS-RではSASと比べて約半分となった。次に放射線抵抗性細胞が癌幹細胞化しているかどうかを検証するため、癌幹細胞マーカーであるCD44、CD133およびALDHを使用し、フローサイトメトリー法により、3種のマーカー全てに陽性を示す細胞割合を測定した。陽性細胞割合はSAS-RでSASと比較して約4倍、HSC2-RでHSC2と比較して約5倍増加していることが明らかになった。したがって、口腔扁平上皮癌においても、放射線抵抗性を獲得した細胞株では癌幹細胞割合が有意に増加していることが示唆された。放射線治療においては、この放射線抵抗性細胞を撲滅することが重要で、それら細胞は癌細胞の割合が高く、癌幹細胞はヒアルロン酸合成能が高いという報告がある。従って、口腔扁平上癌の幹細胞殺傷を目的とする手段として、当初の予定通り、ヒアルロン酸阻害を検討していく。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
1: Research has progressed more than it was originally planned.
Reason
概要に記載したように、口腔扁平上皮癌細胞株のSAS、HSC2およびそれぞれの放射線抵抗性株であるSAS-R、HSC2-Rの放射線感受性および癌幹細胞割合について検証した。X線照射時の生存率をコロニー形成能により測定した結果、いずれの線量においても、放射線抵抗性細胞株で有意に生存率が上昇し、アポトーシス細胞割合は両細胞株ともに経時的にアポトーシスの割合が増加したが、SAS-RではSASと比べて約半分となった。当初予定の上記実験に加え、SASおよびSAS-RのDNA損傷修復動態を評価するために、DNA2本鎖切断マーカーであるγH2AXを使用し、X線照射から1～24時間後にフローサイトメトリー法により検証した結果、SASは1時間後に発現が最大となり、SAS-Rは3時間後に最大となった。この現象の詳細はまだ不明のため、今後詳細を検討する。HSC2およびHSC2-Rについては、両細胞ともに3時間後に最大値を示したが、発現量に有意差はみとめられなかった。X線照射した際の細胞周期に関しても、照射から1～24時間後にフローサイトメトリー法により検証した。SASおよびHSC2とそれぞれの放射線抵抗性株について、細胞周期分配の違いはみとめられなかった。以上の結果より、放射線抵抗性を獲得した細胞株は生存率が増加したが、DNA損傷修復能は変化しないことが示唆されたことから、抗酸化能が増加している可能性が考えられた。
これら実験中に、放射線照射中の癌幹細胞に関する文献を渉猟し、総説を執筆し掲載された。（細川ら、保健科学研究 10(1),2019）また、弘前大学病院の口腔扁平上皮癌患者の臨床結果をまとめ、癌幹細胞が予後とくに遠隔転移に影響する可能性を示唆する英文論文を作成し掲載された。（Oyama et.al. Oncology Letters 19, 2020 ）
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| Strategy for Future Research Activity |
2019年度の実験において、口腔扁平上皮癌における放射線抵抗性細胞は癌幹細胞の割合が高く、また、臨床研究から放射線抵抗性細胞が転移を誘発する可能性が得られた。一方、ヒアルロン酸合成は癌細胞の予後不良因子であることが知られている。そこで、2020年度においては、初めに癌幹細胞の多い放射線抵抗性細胞のヒアルロン酸産生が増加しているか検討する。具体的には、４種（SAS, SAS-R, HSC2, HSC2-R）の細胞にX線を4-10Gy照射し、その培養上清を採取し、上清中のヒアルロン酸量を、ヒアルロン酸定量測定キットを用い測定し比較検討する。次に、転移の指標である遊走能および浸潤能を、遊走浸潤アッセイにて測定し、放射線抵抗性細胞において転移能が上昇しているか検討する。またヒアルロン酸合成阻害薬である４メチルウンベリフェロン（4-MU）を添加することに、ヒアルロン酸合成量が低下し、遊走能、浸潤能が低下するか検討する。
また、余力があれば4-MUを添加した場合のヒアルロン酸産生関連遺伝子、および癌転移関連遺伝子、サイトカイン関連遺伝子の分析を行い、照射および4-MUの投与効果を分子生物学的に検討する。
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