2020 Fiscal Year Research-status Report
放射線抵抗性口腔癌に対するヒアルロン酸産生阻害を応用した併用放射線治療の研究
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19K08141
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| Research Institution | Hirosaki University |
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Principal Investigator |
細川 洋一郎 弘前大学, 保健学研究科, 教授 (70173599)
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| Project Period (FY) |
2019-04-01 – 2022-03-31
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| Keywords | 放射線治療 / 放射線抵抗性 / 癌幹細胞 / ヒアルロン酸 / 口腔癌 |
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| Outline of Annual Research Achievements |
2020年度は、口腔扁平上皮癌細胞株HSC2、HSC3およびそれぞれの放射線抵抗性細胞株であるHSC2-R、HSC3-Rに対するヒアルロン酸合成阻害剤 4-methylubelliferone (4-MU)の放射線増感効果および抗浸潤・転移効果について検証した。まず4-MUのヒアルロン酸合成阻害効果を確かめるために、ヒアルロン酸合成酵素 (HAS)のmRNA発現をRT-qPCRで測定したところ、HSC2-RのHAS3 mRNA発現はHSC2よりも有意に上昇していたが、4-MU存在下では、コントロールと比較して有意に減少した。また、転移能の指標としてCD24の平均蛍光強度をフローサイトメトリーで測定したところ、4-MU投与によってそれぞれのコントロールよりも蛍光強度が増加し、CD44+ / CD24-細胞割合も減少することが確認された。コロニー形成アッセイによって細胞生存率を評価したところ、2 Gy X線照射したHSC2-RおよびHSC3-Rはそれぞれの非放射線抵抗性細胞株よりも有意に生存率が上昇した一方で、4-MU投与により減少した。ところがヒアルロン酸分解酵素（ヒアルロニダーゼ）を投与しても、それぞれの細胞株において、コントロールと同等の生存率であった。遊走能を創傷治癒アッセイにて測定したところ、それぞれの抵抗性細胞株は非抵抗性細胞株よりも遊走能が低くなっていることが明らかになった。以上の結果から、ヒアルロン酸合成阻害剤による放射線増感効果には、細胞外からのヒアルロン酸とその受容体の相互作用とは別の経路が影響している可能性が示唆された。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
上述したように、口腔扁平上皮癌細胞株HSC2、HSC3およびそれぞれの放射線抵抗性細胞株であるHSC2-R、HSC3-Rに対するヒアルロン酸合成阻害剤 4-methylubelliferone (4-MU)の放射線増感効果および抗浸潤・転移効果についての検証を達成することができ、現在、英文論文を執筆中である。
これらの実験結果を踏まえ、今後はsiRNAを使用してHAS3を一過性にノックダウンし、放射線増感効果や細胞遊走への影響を評価する。また、その際の炎症に関連したシグナル伝達経路に関して調査を行う。
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| Strategy for Future Research Activity |
今後はsiRNAを使用してHAS3を一過性にノックダウンし、放射線増感効果や細胞遊走への影響を評価する。また、その際の炎症に関連した経路に関して調査を行う。
１）siRNAを使用したmRNAノックダウン。 これまでの研究成果及び口腔癌細胞の知見をもとに口腔扁平上皮癌細胞株HSC2、HSC3およびそれぞれの放射線抵抗性細胞株であるHSC2-R、HSC3-Rに対して、siRNAによるHAS3ノックダウンを行う。ノックダウン効率は、RT-qPCRによるmRNA発現及びウェスタンブロットによるタンパク発現の測定で評価する。
２）mRNAノックダウンによる放射線感受性への影響評価。HAS3ノックダウン細胞を回収し、コロニー形成アッセイにて放射線感受性の評価を行う。細胞内ROSレベルについてもフローサイトメトリーで評価する。また炎症性サイトカインに対する影響をRT-qPCRにて評価し、 細胞外ヒアルロン酸と受容体の相互作用とは別に、放射線抵抗性細胞の放射線増感に影響する細胞内経路を調査する。以上から、放射線抵抗性細胞の放射線増感に関連した経路の同定及びヒアルロン酸合成阻害効果の有効性を検証する。
３）mRNAノックダウンによる細胞遊走への影響評価。HAS3ノックダウン細胞について創傷治癒アッセイを行い、細胞遊走に対するノックダウンの影響を評価する。また、BCAタンパクアッセイにてノックダウン細胞からタンパクを抽出し、EMTマーカー発現についてウェスタンブロットで評価する。さらに、転移開始の最初のステップと考えられているプログラム細胞死 (アノイキス)ついてAnnexin V / PI二重染色で評価する。以上から、放射線抵抗性細胞の転移抑制にヒアルロン酸合成阻害が有効であるかを検証する。
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| Causes of Carryover |
コロナ禍の影響により、実験施設の使用期間が限定され、学会参加の機会が減少したことで残金が生じた。翌年もオンラインによる学会参加が継続すると思われるが、論文を作成し（一部は既に執筆中）、残金を論文の投稿費に利用し、社会に対して研究成果を報告する予定である。
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