がん放射線治療後に起きるがん免疫応答経路の選択に関わるスイッチ分子の探索

2019 Fiscal Year Research-status Report

• Project/Area Number: 19K08146
• Research Institution: The University of Tokyo
• Principal Investigator: 善光 純子 東京大学, 大学院新領域創成科学研究科, 特任研究員 (20710148)
• Co-Investigator(Kenkyū-buntansha): 鈴木 絢子 東京大学, 大学院新領域創成科学研究科, 特任准教授 (00770348) ; 鈴木 穣 東京大学, 大学院新領域創成科学研究科, 教授 (40323646) ; 坪井 康次 筑波大学, 医学医療系, 名誉教授 (90188615)
• Project Period (FY): 2019-04-01 – 2022-03-31
• Keywords: アブスコパル効果 / 放射線治療 / 免疫応答 / オミクス解析 / 免疫応答スイッチ分子 / シングルセル解析

Outline of Annual Research Achievements

C57BL/6マウスの大腿部皮下にGL261（同マウス由来のGlioma細胞：MHC-I、PD-L1の発現が確認されており、腫瘍免疫研究に多く使われている）腫瘍細胞を移植し、10日後大腿皮下に腫瘍が定着したことを確認してから10GyのX線を照射した。X線照射を施したマウスを2群に分け（9匹ずつ）、一方の群に抗PD-1抗体を3mg/kgの投与量で、1日おきに3回腹腔内へ投与した。さらに24日後、抗PD-1抗体投与群、未投与群の両群に、同じ腫瘍細胞を頭蓋内に再移植した。大腿部腫瘍については、腫瘍確認後、その増殖を週に1回計測し、腫瘍大を観察した。
抗PD-1抗体投与群では治癒マウスと増悪マウスはそれぞれ6匹と3匹、未投与群では3匹と6匹であり、マウスにおいて腫瘍へのX線照射後の抗PD-1抗体投与は効果があることが確認できた。
マウスからの試料の採取については、腫瘍移植前、腫瘍移植後、X線照射後、腫瘍細胞再移植後、および腫瘍が治癒し長期生存したマウスについては治癒後に、経時的に血液200μL程度をランセットを用いて顎静脈から採取した。採取した血液から直ちに密度勾配法（キット）を用いて、血漿と末梢血単核球（PBMC）を調製し、凍結保存した。全てのポイントでの採血が終了した後、抗PD-1抗体投与・未投与の両群について、治癒したマウスと増悪したマウス各1匹ずつ、合わせて4匹を選び、各々採血4ポイント分（合計16サンプル）についてPBMCを10ｘChromiumシステムを用いて、scRNA-Seq用のライブラリ調製が終了した。

Current Status of Research Progress

2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.

Reason

マウス実験については、概ね計画通りに進捗した。20匹のC57BL/6マウスの大腿部にGL261腫瘍細胞を移植し、腫瘍の定着を確認してから10GyのX線を照射した。X線照射後のマウスを2群に分け（各9匹）、一方に抗PD-1抗体を3mg/kgの投与量で1日おきに3回投与した。さらにX線照射から24日後に同じ腫瘍細胞をマウス頭蓋内へ再移植し、大腿皮下腫瘍については経時的に腫瘍大を計測して、経過を観察した。その結果、抗PD-1抗体投与群では治癒したマウスが67％、非投与群では33％と、抗PD-1抗体の効果が認められた。
また実験の各処理の前後で経時的にマウスから血液を採取した。当初は、マウスから採取した血液から、血漿とPBMCを得て、PBMCからtotal RNAを調製し、バルクでRNA-Seqを行う予定であったが、バルクでの解析では免疫関連細胞群の経時的な変化を解析することが困難と考え、シングルセル解析を行うこととした。解析できるマウスの匹数が非常に限られるが、抗PD-1抗体投与群、未投与群それぞれについて、治癒と増悪の1例ずつ、計4匹分、4タイムポイントのライブラリ調製が終了した。今後シークエンス解析を行う予定である。
また、血漿からはSmall RNAの解析を予定している。採取できた血漿がごく少量のため、難しい場合は、サイトカインの解析を行うことも検討する。

Strategy for Future Research Activity

調製したscRNA-Seqライブラリをイルミナ社製シークエンサーにより解析しする。産生した配列について、scRNA-Seq用解析パイプラインであるCell Rangerにより、生データの処理をし、Loupe Cell Browserにより可視化し、放射線治療とPD-1抗体の組み合わせおよび、治癒群、増悪群のそれぞれで、どのような（免疫）細胞のポピュレーションの変化があるかを考察する。またMonocle等のツールを使用した解析により、各発現遺伝子の経時的変化についても考察する。その中で、治癒群もしくは増悪群に特異的な細胞群や発現の変化、また両群間で発現に差が認められた遺伝子を選択し、データベースよりヒトホモログの配列を得る。さらにパスウェイ解析やGene Ontology解析、公共データベース（DBKERO等）との比較から腫瘍免疫応答に関わる遺伝子との関連を明らかにし、ターゲット分子の絞り込みを行う。
PBMCと同時に調製し保存した血漿について、small RNAをキットを用いて調製し、シークエンス解析を行う。scRNA-Seq解析と同様に両群間で差異の認められるsmall RNAを選択し、その機能の確認を行う。
シングルセル解析とsmall RNAの解析から、放射線治療で腫瘍が治癒するために必要な免疫応答（分子）を見出し、データベース解析によりヒトホモログを探索する。