スーパーエンハンサー機能異常を介した悪性ラブドイド腫瘍の分子病態の解明

2019 Fiscal Year Research-status Report

• Project/Area Number: 19K08257
• Research Institution: Kyoto Prefectural University of Medicine
• Principal Investigator: 桑原 康通 京都府立医科大学, 医学(系)研究科(研究院), 講師 (30590327)
• Co-Investigator(Kenkyū-buntansha): 奥田 司 京都府立医科大学, 医学(系)研究科(研究院), 教授 (30291587)
• Project Period (FY): 2019-04-01 – 2022-03-31
• Keywords: SWI/SNF複合体 / ラブドイド腫瘍 / スーパーエンハンサー / RUNX1

Outline of Annual Research Achievements

ヒト腫瘍の発生には複数のゲノム遺伝子変異の蓄積が必要とされるが、悪性ラブドイド腫瘍(MRT)は、ゲノム上ただ一つの遺伝子変異（SNF5遺伝子変異）により発症する腫瘍である。最近になってDNAメチレーションアレイの手法を用いた解析から、DNAのメチル化状況の相違によりTYR、SHH、MYCの3つのsubgroupに分類され、TYR subgroupは比較的予後が良好とされる一方で、SHHとMYC subgroupはより予後が不良になると報告された。中でもMYC subgroupは、有効な治療標的の候補も同定されておらず、MRT全体の予後改善のためにはMYC高発現のメカニズムの解明とその制御手法の確立が必要である。
一方で、SNF5はクロマチンリモデリングにおいてカギとなり、その欠損によってMRT細胞では様々な遺伝子の発現に影響が生じ、ここに関わる遺伝子制御機構の解明が急務である。我々は、SNF5欠損によって複数の構成因子が欠落するため不完全なSWI/SNF複合体（SWI/SNFΔ複合体）が形成されることを明らかにしたが、さらにSWI/SNFΔ複合体によって、スーパーエンハンサーを介した遺伝子発現制御の異常ももたらされる。しかし、SWI/SNFΔ複合体によるエンハンサー機能異常のメカニズムは解明されていない。我々はSWI/SNFΔ複合体は転写関連因子との機能協調機構が破綻することによってエンハンサー機能に影響されるという仮説を立てた。
ここで、転写因子RUNX1はMYCのエンハンサー領域で結合しエンハンサー機能に影響する。またSWI/SNF複合体とも機能協調することから、RUNX1に着目し検討を始めた。RUNX1とSWI/SNF複合体の機能協調メカニズム解明し、クロマチンリモデリングとMRT発生との関連を検討し、そのエピジェネティクス発がん機構の解明と、新規治療戦略の確立を目指す。

Current Status of Research Progress

3: Progress in research has been slightly delayed.

Reason

我々は新規に樹立したKP-MRT-KSa細胞株について解析し、この細胞がMYC subgroupに合致することを明らかにした。他のMRT細胞株であるA204、G401、TTC642、そしてTTC549はいずれもMYC subgroupに分類される。これらの細胞株におけるMYCの発現を確認したところ、A204、G401、TTC642、TTC549のMYCのmRNA発現とタンパクの発現は相関していたが、KP-MRT-KSa細胞では相関せず、A204、G401、TTC642、TTC549を用いて解析をすすめた。また、これらの細胞株ではRUNX1の発現が、mRNAとタンパク発現の双方で認められなかった。
そこで当該研究では、引き続きMRT細胞株でSNF5やRUNX1の発現によるMYC遺伝子発現への影響を検討した。まず、A204細胞にSNF5、RUNX1またはその両方を遺伝子導入し、MYCのmRNAの変化を定量的PCR法で、MYCのタンパク量の変化をWestern blot法で確認した。結果、SNF5とRUNX1両方の遺伝子を導入した群でわずかにMYC mRNAとタンパク発現量の低下傾向を認めたが、SNF5、RUNX1単独では影響を認めなかった。重ねてTTC549 やTTC642細胞でも追加検討したが、MYC遺伝子への効果は確認できなかった。そこで、これらMRT細胞株への遺伝子導入効率を検討したところ、導入効率はA204で60%程度、その他の細胞では30%未満であり、遺伝子導入効率の影響により結果が影響されている可能性が考えられた。このように当初計画では想定していなかった困難が出現したため、回避目的で、Tet-onシステムを導入し確実に目的の遺伝子が導入できる実験系の構築に取り掛かっている。以上のように当初予定よりもわずかに進行は遅れているものの、確実な前進をしているものと考えている。

Strategy for Future Research Activity

遺伝子導入法を一過性発現手法からTet-onシステムへと変更する。これによってTet-onシステムによって確実に遺伝子を発現できる状況が期待できる。以降は、このシステムによってSNF5、RUNX1発現させ、MRTにおけるMYC遺伝子の発現変化について確定する予定である。さらに、その遺伝子変化はエンハンサー機能が変化することによるのかどうか実験を勧める。具体的には、まず、MRTにおけるMYC遺伝子のエンハンサーがどの領域にあるのか、ChIP-seqによるH3K27acやBRD4のリクルートメント解析によって確定させる予定である。また、SNF5やRUNX1の発現によって、そのMRTで活性化されているエンハンサー領域が変化するのかどうか、その領域へのSNF5、RUNX1、あるいはBRG1などのリクルートメントがどのように変化しているかといった解析を、ChIP－seqやChIP-QPCR法によって行う。また、補完的アプローチとしてMYCプロモーターへの影響の有無についても検討は必要であり、MYC遺伝子プロモーターをpGL3に入れルシフェラーゼアッセイを行って検討することも計画している。これらによって、MRTにおけるMYC subgroupの形成のメカニズムに迫っていけると考えている。さらに、MYCのエンハンサー・スーパーエンハンサー機能を抑制する可能性が予測されるCDK7阻害剤やJQ1等の効果を検証し、新規治療薬の候補を探索して行きたいと考えている。