Direct reprogramming法を用いた先天性大脳白質形成不全症の解析

2020 Fiscal Year Research-status Report

• Project/Area Number: 19K08270
• Research Institution: Tohoku University
• Principal Investigator: 植松 貢 東北大学, 医学系研究科, 准教授 (90400316)
• Co-Investigator(Kenkyū-buntansha): 植松 有里佳 (沼田有里佳) 東北大学, 大学病院, 助教 (70735779)
• Project Period (FY): 2019-04-01 – 2022-03-31
• Keywords: 先天性大脳白質形成不全症 / ミトコンドリア / 低分子RNA / Direct reprogramming

Outline of Annual Research Achievements

本研究は、①Direct reprogramming法によりPNPT1遺伝子異常症例の線維芽細胞から、神経細胞に加えてオリゴデンドロサイトなどへの分化誘導する系を確立しその病態解析を行う、②ラットやマウスの中枢神経や末梢神経の培養組織においてPNPT1やPOLR3Bなどの遺伝子をノックダウンして病態解析を行う、③ ①の系を用いた簡便な治療薬スクリーニングの系を確立する、ことを目的としている。
2年目の本年度は、まず前年度で確立したDirect reprogrammingh法による患者由来線維芽細胞から神経細胞へ分化誘導する系について、コントロールに比して患者由来細胞では神経細胞に分化すると早期にアポトーシスを起こしてしまう現象について、培養条件を変えて解析が可能かどうか検討し、用いた解析の問題点の修正を試みた。患者由来線維芽細胞はコントロールに比して細胞分裂速度自体が遅く、シャーレ内でコンフルエントになりにくいため、各種培養因子や導入遺伝子が過剰になる可能性が考えられ、培養条件を検討中である。
また、前年度から引き続き、ラットの脊髄後根神経節細胞を初期培養して低分子RNA関連遺伝子のノックダウン解析を行った。それらの神経軸索の成長が障害され、さらに髄鞘も形成されないことを免疫染色にて確認できた。そのメカニズムについて、2018年にインターフェロンの関与を示唆する報告があり、今後検討予定である。
最後に、中枢神経での解析系確立のため、ラット脳を用いたオリゴデンドロサイト初期培養を試みたが、やはり確立が困難であった。そこで、2020年から2021年にかけて、Direct reprogramming法を用いたオリゴデンドロサイトへの分化方法について画期的な報告があったため、その発現ベクター供与を論文著者へ連絡中であり、今年度それを用いて解析を進める予定である。

Current Status of Research Progress

3: Progress in research has been slightly delayed.

Reason

症例の線維芽細胞の分裂速度が遅く、神経細胞へ分化すると早期にアポトーシスを起こしてしまう問題がまだ未解決である。ラット末梢神経の初期培養系は確立して解析が進んでいるが、機序についてインターフェロンの関与を調べる方法を検討中である。中枢神経についてはラット脳の初期培養系確立が困難であったため、検討を行って別の方法を試みることとした。

Strategy for Future Research Activity

2020度の問題点を踏まえ、①Direct reprogrammingの各種条件の見直し(PNPT1のsiRNA量など）、②ラット末梢神経細胞を用いた系での低分子RNAノックダウンサンプルにおけるインターフェロン異常の検討、③2021年に報告された新しい方法（Direct reprogrammingを用いた線維芽細胞からオリゴデンドロサイトへの分化）を進める。

Causes of Carryover

ラットを用いた中枢神経の培養に関する研究について、培養系の確立が遅れたため進捗状況が予定より遅れていること、Direct Reprogrammingを用いた神経細胞培養の系についても、薬剤スクリーニングを行える条件がまだ整っておらず、スクリーニング用の薬剤購入などが次年度にずれ込んだ。2021年度は中枢神経へのDirect reprogrammingを新しく開始するにあたり、発現ベクターや培養試薬などの準備に多くの費用が必要になる。