神経芽腫に対するGD2を標的とした新規キメラ抗原受容体遺伝子改変T細胞療法の開発

2020 Fiscal Year Research-status Report

• Project/Area Number: 19K08273
• Research Institution: Nagoya University
• Principal Investigator: 西尾 信博 名古屋大学, 医学部附属病院, 特任講師 (00586430)
• Co-Investigator(Kenkyū-buntansha): 高橋 義行 名古屋大学, 医学系研究科, 教授 (40432273)
• Project Period (FY): 2019-04-01 – 2022-03-31
• Keywords: キメラ抗原受容体 / GD2 / piggyBac

Outline of Annual Research Achievements

1)GD2特異的キメラ抗原受容体(GD2.CAR)トランスポゾンベクターの作製:異なる抗原認識部位の配列情報とCD28、4-1BBなどの共刺激分子の組み合わせにより、複数のGD2.CARコンストラクトを作成した。作成したGD2.CARを、研究代表者が所有するCD19.CARトランスポゾンベクター(pIRII-CD19.28.z)の CAR配列と入れ替え、GD2.CARトランスポゾンベクターを作成した。さらに、ヒトIL-15の遺伝子も組み込み、遺伝子導入されたCAR-T細胞がIL-15を産生するコンストラクトも作成した。
2)piggyBacトランスポゾン法によるGD2.CAR遺伝子の導入およびGD2.CAR-T細胞の培養:研究代表者らが開発したpiggyBacトランスポゾン遺伝子導入法を用いて、GD2.CAR遺伝子をT細胞に導入し、GD2.CAR-T細胞を培養した。末梢血単核球にヌクレオフェクション装置を用いて、GD2.CARトランスポゾンベクターとpiggyBac遺伝子転位酵素ベクターを導入した。インターロイキン(IL)-7およびIL-15を添加した培地中で培養した。 複数のヌクレオフェクション装置を用いて遺伝子導入効率や培養効率をみることで、最適な培養方法の確立を目指した。培養開始14日目にフローサイトメトリーを用いてT細胞上のGD2.CAR発現率を測定し、30-50%の遺伝子導入効率を得ることができた。
3)In vitro実験系を用いたGD2.CAR-T細胞の抗腫瘍効果の評価:CAR-T細胞と神経芽腫細胞株をサイトカイン無添加・10%血清存在下で共培養し、GD2.CAR-T細胞 の抗原特異性、細胞傷害活性を確認した。

Current Status of Research Progress

2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.

Reason

複数のGD2.CARコンストラクトを作成し、CAR発現トランスポゾンベクターをそれぞれ作成できた。また、サイトカイン産生CAR発現トランスポゾンベクターも作成した。ヌクレオフェクション装置とパルス条件およびプラスミド添加量の最適化を行い、我々が開発した培養法を用いて、高い遺伝子導入効率を達成し、腫瘍細胞との共培養により、抗腫瘍効果を確認できたため。

Strategy for Future Research Activity

複数のコンストラクトの機能を同時に比較していくことで、最適なGD2.CARを選択する。in vitroでの比較実験とともに、免疫不全マウスでの異種移植モデルを使用し、in vivoでの抗腫瘍効果および安全性を観察することにより、最適なGD2.CARを選択し、臨床試験へ応用できるようにする。

Causes of Carryover

新型コロナウイルスの蔓延により、出張などがとりやめになったことで旅費が少なくなったため、次年度使用金が生じた。次年度は、抗体などの消耗品を購入する予定である。

Research Products

• [Presentation] 非ウイルスベクター法によるＣＡＲ－Ｔ細胞療法臨床試験 (2020)
  • Author(s): 西尾信博
  • Organizer: 第123回日本小児科学会
• [Presentation] タイにおけるPiggyBacトランスポゾン法によるCD19キメラ抗原受容体遺伝子改変T細胞療法臨床第Ｉ相試験への技術支援 (2020)
  • Author(s): 西尾信博, Nattiya Hirankarn, Udomsak Bunworasate, Koramit Suppipat, Supannikar Tawinwang, Rattapoom Thaiwong, Suparat Tudsamran, 中沢洋三, 濱田太立, 市川大輔, 西川英里, 川島希, 成田敦, 村松秀城, 小島勢二, 高橋義行
  • Organizer: 第12回血液疾患免疫療法学会
• [Presentation] Evaluation of next-generation sequencing-based minimal residual disease analysis after CAR-T therapy (2020)
  • Author(s): Nobuhiro Nishio, Motoharu Hamada, Yusuke Okuno, Masayuki Imaya, Taro Yoshida, Ayako Yamamori, Shunsuke Miwata, Kotaro Narita, Hironobu Kitazawa, Daisuke Ichikawa, Nozomu Kawashima, Eri Nishikawa, Atsushi Narita, Hideki Muramatsu, Kai Wang, Huyong Zheng, Lung-Ji Chang, Seiji Kojima, Yoshiyuki Takahashi
  • Organizer: 第82回日本血液学会