新生児・早産児における免疫寛容及び免疫応答機構の統合的免疫細胞・分子学的解析

2019 Fiscal Year Research-status Report

• Project/Area Number: 19K08293
• Research Institution: The University of Tokyo
• Principal Investigator: 高橋 尚人 東京大学, 医学部附属病院, 教授 (50197159)
• Project Period (FY): 2019-04-01 – 2022-03-31
• Keywords: 臍帯血 / 免疫寛容 / スーパー抗原 / 制御性T細胞 / naiveT細胞 / TSST-1 / 新生児

Outline of Annual Research Achievements

新生児免疫寛容の機序を明らかにすべく、臍帯血を用いた研究を開始した。過去に研究報告がほとんどない臍帯血と成人末梢血のCD45RO-naiveT細胞の機能比較を行うことにし、これにより具体的な寛容誘導機序が明確になると考えた。臍帯血と成人血からのCD45RO-細胞は磁気ビーズ法によるnegative selectionで、刺激実験に使う単球はpositive selectionで回収した。それぞれ十分量の細胞を回収できることを確認し、スーパー抗原TSST-1での刺激を行い、dose-responseおよびtime courseでの細胞及び培養上清を回収した。現時点で６例ずつ程度の対象が得られている。また、TSST-1刺激後の細胞（T細胞および単球）はflow cytometerにより表面抗原解析とソーティング回収を行った。回収細胞はRNA抽出後、遺伝子発現RNA-seq解析を提出した。回収した培養上清ではサイトカインプロファイルを確認した。さらに、刺激後の細胞増殖を確認できるようにしており、細胞内染色・表面抗原染色による制御性T細胞の評価と合わせて評価していく予定である。
現時点で、TSST-1刺激で増幅するVbeta2陽性T細胞はTCRの細胞内への移動により表面抗原としては確認できなくなることを考慮すべきこと、成人血に比べて臍帯血は増殖能が高いこと、サイトカイン産生ではIL-2、IFNγ産生は臍帯血の方が強いことなどの結果を得ている。RNA-seqの結果はこれから解析という段階である。
このように試行錯誤の上だったが、多くの知見が得られ、新生児免疫能の特徴が明らかになりつつある。過去の報告と必ずしも一致しない部分もあり、全体像をどのように表現できるかはこれからの研究次第であるが、おそらく新生児も活発な免疫応答能を有し、特に制御性T細胞の機能が高いことが明らかになると期待される。

Current Status of Research Progress

2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.

Reason

応募時の研究成果目標は1.新生児免疫寛容への制御性T細胞の関与と関連する遺伝子発現調節を明らかにすること、2.早産児の免疫制御異常となりうる免疫系遺伝子発現調節の弱点を明らかにすること、3. 在胎週数別に免疫寛容・免疫制御機構がどのように変化するかを明らかにすることとしていた。この目標の中で1が最も研究手法の確立のための検討が必要な事項と考えていた。
この1年間、実際に臍帯血と成人血のスーパー抗原刺激の実験を行う中で、種々の思いがけない事象が見つかり時間を要したが、臍帯血と成人末梢血それぞれのCD45RO-naiveT細胞の機能比較を行うという具体的な研究目的を決定でき、negative selectionとpositive selectionによる細胞回収法も確立した。十分量の細胞を回収できることを確認し、臍帯血と成人血６例ずつの参加対象者を得て、TSST-1刺激後の細胞回収、回収細胞のRNA抽出後のRNA-seq解析、培養上清でのサイトカインプロファイル解析を行うことができた。
また並行して、TSST-1刺激によりVbeta2陽性T細胞のTCRがきれいに細胞内に移動してしまい解析に工夫がいることからその調整をしたこと、成人血と臍帯血T細胞の増殖能をみるべきと考えられflowcytometryで解析できるようにしたことなど、新たな研究方法も確立できた。
具体的な多くの知見が得られ、新生児免疫能の特徴が明らかになりつつあり、困難な中ではあったが、順調な進捗と言える。
一方で、2と3の課題は全くこれから取り組むという段階であり、次年度に取り組む予定である。これらは一例一例、数を増やしていくだけにはなるので、研究手法という意味で多くの時間を要するわけではないと考えている。

Strategy for Future Research Activity

応募時の研究成果目標は1.新生児免疫寛容への制御性T細胞の関与と関連する遺伝子発現調節を明らかにすること、2.早産児の免疫制御異常となりうる免疫系遺伝子発現調節の弱点を明らかにすること、3. 在胎週数別に免疫寛容・免疫制御機構がどのように変化するかを明らかにすることとしており、1年間の研究で1については、具体的な研究目的を決定でき、臍帯血と成人血６例ずつの参加対象者を得て、種々の成果を得た。従って、この点については今後、参加者を増やし10例ずつ程度の解析を行い、一定の結論をまとめる予定である。新たな手法はないため、大きな困難はないと考えている。
さらに、2年目は目標の2と3の課題について参加者を募り、早産児の免疫応答について1と同様の手法を用いて、その特徴を成人血さらに正期産児の臍帯血と比較し解析を行って行く。この2と3の目標の研究手法上の課題として、臍帯血が十分量取れない可能性があることである。しかし、目標1で得られた知見から、必要な解析ポイントを絞ることで、一定の結果は得られると思われる。
2年目はこのような形で研究を続け、目標1については年度後半には学会、論文等での報告を行って行きたいと考えている。