2020 Fiscal Year Research-status Report
TRECK法によるミクログリア除去モデルを用いた脱髄性疾患とてんかんの病態解明
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19K08311
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| Research Institution | Tokyo Metropolitan Institute of Medical Science |
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Principal Investigator |
佐久間 啓 公益財団法人東京都医学総合研究所, 脳・神経科学研究分野, プロジェクトリーダー (50425683)
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| Project Period (FY) |
2019-04-01 – 2022-03-31
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| Keywords | ミクログリア / ジフテリア毒素 / TRECK法 / 実験的自己免疫性脳脊髄炎 / けいれん重積 |
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| Outline of Annual Research Achievements |
本研究の目的は、小児神経疾患のマウスモデルの様々な病相においてTRECK法を用いてミクログリアを除去することで、疾患におけるミクログリアの役割を明らかにすることである。TRECK法とはマウスの特定の細胞にジフテリア毒素受容体(DTR)を発現させ、ジフテリア毒素(DT)を投与することで標的細胞を死滅させるシステムである。最初に組織特異的にDTを発現させるためのノックイン(DTR-KI)マウスを作成した。Rosa26遺伝子領域にloxp配列で挟んだSTOP カセットを挿入し、その下流にDTR (ヒトHB-EGF)遺伝子とTd tomato遺伝子を挿入したtargetingベクターを作成した。このベクターをRENKA (B6N) ES cellsに電子穿孔法により導入し、得られた陽性クローンをCD1マウスに移入してキメラマウスを作成した。ミクログリア特異的発現を誘導するCreマウスとしてはCX3CR1-CreERT2マウスを用いた。DTR-KI雌マウスとCX3CR1-CreERT2雌マウスを交配し、CX3CR1- iDTRマウスを作成した。まずDTによるミクログリアの除去効果を確認するため、in vitroで検証を行なった。日齢3のCX3CR1- iDTRマウス脳より混合グリア培養を作成し、10日後より4-hydroxy-tamoxifenを2日間投与した。1週間後にDTを2日間投与したところ、2日後をピークに培養細胞中のミクログリアは1%未満にまで減少した。現在はin vivoの効果を確認する作業を進めている。日齢14と15にtamoxifen 1mg/匹を皮下投与し、生後6週でDTを投与するというプロトコールで検討を行なっている。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
4: Progress in research has been delayed.
Reason
2020年度は新型コロナウイルス感染症拡大の影響で、動物実験の実施に多大な支障を来した。動物実験施設における飼育数を削減する必要があったため、遺伝子改変マウスの交配作業が大幅に遅延し、十分な数のマウスを得ることができなかった。また在宅勤務が増加した結果、長期間の観察を要するin vivoの実験を殆ど行うことができなかった。このためTRECK法の効果を検証するための代替法としてin vitroによる検証を行なった。
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| Strategy for Future Research Activity |
新型コロナウイルス感染症は未だ終息が見通せない状況のため、TRECK法によるミクログリア除去の実験が軌道に乗るまでにはかなりの時間がかかると予想される。そこで実験的自己免疫性脳脊髄炎やpilocarpine投与によるけいれん重積など、疾患動物モデルの予備的検討を進める。新型コロナウイルスに対するワクチンの普及などにより7月以降にはCX3CR1-iDTRマウスを用いた実験を本格的に再開できる見込みであり、DT投与の効果を確認した上で速やかに疾患動物モデルによる解析を開始したい。
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| Causes of Carryover |
CX3CR1-iDTRマウスを用いる実験が大幅に遅延したため、必要な物品購入が予定より大幅に減ったので、次年度使用額が生じた。
次年度は遅れている研究計画を順次進めるために、試薬や動物飼育関連のための費用を支出する予定である。
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