2019 Fiscal Year Research-status Report
Development of novel drugs for tuberous sclerosis complex
| Project/Area Number |
19K08334
|
|---|
| Research Institution | Tokyo Metropolitan Institute of Medical Science |
|---|
Principal Investigator |
久恒 智博 公益財団法人東京都医学総合研究所, 脳発達・神経再生研究分野, 主席研究員 (10321803)
|
|---|
| Project Period (FY) |
2019-04-01 – 2022-03-31
|
| Keywords | human iPS cells / dendritic spine / neuron |
|---|
| Outline of Annual Research Achievements |
結節性硬化症(TSC)は全身の過誤種を特徴とする難病である。その神経症状として、てんかん・自閉症・知的障害などが問題となっている。Tscの変異により活性化されたmTORの活性化が深く関与していると考えられているが研究代表者の所属研究室では、mTOR阻害剤ではなく、その上流の低分子量Gタンパク質Rhebに対する阻害剤だけが、結節性硬化症ラットモデルの神経シナプスの形態異常を正常に戻すことを以前報告した。この現象がヒト神経細胞でもあてはまるのか明らかにし、新たな結節性硬化症の薬を開発することを目的としている。
本年度はTsc変異型ヒトiPS細胞を樹立し神経細胞に分化させその形態的・生理的な特徴を明らかにすることを目的とした。Tsc2遺伝子のエキソン３の領域をターゲットとするguideRNA およびCas9をコードするプラスミドをエレクトロポレーション法にてヒトiPS細胞に導入し変異株を取得した。その結果ホモTsc2変異型およびヘテロTsc2変異型のiPS細胞を取得することができた。さらにウエスタンブロッテイング法や免疫染色法によりTSC２の発現が欠失していることを確認した。さらにその細胞から胚様体を作製して神経細胞へ分化させた。マウスの初代神経細胞は約３週間で樹状突起スパインが形成されるが、ヒト樹状突起スパインの形成は数か月単位での時間を要する。そこで樹状突起スパインの形成がみられ長期培養に適した培養条件の決定のために３種類の培地を用いて比較検討した。またGFPをコードするAAVを感染させてホモ変異型TSC2神経細胞の形態的な違い（軸索伸長や細胞核の大きさ）を明らかにした。さらにFluo8を用いたカルシウムイメージング法により神経ネットワークレベルの神経活動を測定した結果、TSC2欠損型ヒト由来培養神経細胞には特徴的な活動パターンがあることを明らかにした。
|
| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
今年度の計画通りCRISPER-CAS9を用いてTSC2変異型iPS細胞を取得することができた。また取得したTSC2変異型iPS細胞を神経細胞に分化させて長期培養する術を確立することができた。さらにAddgeneより購入したAAV-Syn-GFPを感染させ、TSC2変異型神経細胞の形態的特徴を明らかにできた。一方、pAAV-Syn-GCaM P6f(Addgene)により蛍光タンパク質カルシウムセンサー(GCaMP6f)を神経細胞に発現させてカルシウムイメージング法をおこなう予定であったがGCaMP6fの発現がみられず断念した。AAV-Syn-GFPは発現がみられたため、使用したAAVのセロタイプによる違いかもしれない。そこでカルシウムイメージングは蛍光DyeのFluo8-AMを用いておこなったが、神経細胞の自発的発火の頻度や発火の同調性を３ヶ月に渡って明らかにできた。その結果TSC2欠損型ヒト由来培養神経細胞には特徴的な活動パターンがあることを見出し、それがmTOR阻害剤で抑制されることも明らかにできた。
|
| Strategy for Future Research Activity |
引き続き長期培養を継続して形成された神経細胞の樹状突起スパインの長さや幅を測定し、野生型とTSC変異型の神経細胞との比較をおこなっていく。またRheb阻害剤やmTOR阻害剤を投与してスパインの形態変化を明らかにしていく予定である。一方でTSC2欠損型ヒト由来培養神経細胞には特徴的な活動パターンを見出したので、これがどのようなメカニズムで生じているのかその分子メカニズムを明らかにしていくことも同時に進める予定である。
|
| Causes of Carryover |
低額の残金を有効に使うために次年度に繰り越した。
消耗品費に使用予定
|
