2019 Fiscal Year Research-status Report
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19K08350
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| Research Institution | Yokohama City University |
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Principal Investigator |
柴 徳生 横浜市立大学, 附属病院, 講師 (50600615)
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2019-04-01 – 2022-03-31
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| Keywords | 急性骨髄性白血病 / Chipシーケンス / microRNAシーケンス / 遺伝子解析 / ATACシーケンス |
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| Outline of Annual Research Achievements |
小児急性骨髄性白血病(AML)は小児がんにおいて最も予後不良な疾患の1つであり、これまでの網羅的な遺伝子解析の結果、予後不良な遺伝子再構成であるNUP98-NSD1症例全例においてPRDM16遺伝子が高発現していることを同定し、さらに予後不良AMLの多くでPRDM16遺伝子が高発現となっていることを突き止め、重要なリスク因子として報告してきた。
今回、NUP98-NSD1陽性例2例を含む小児AML検体10例を用いて、ATAC-seq(Assay for Transposase-Accessible Chromatin Sequencing)を施行した。ATAC-seqは、次世代シーケンサーを用いた網羅的にオープンクロマチン領域、すなわち遺伝子の活性化した領域を同定する手法である。本解析により、遺伝子が機能している領域を検出するとともにオープン領域の遺伝子配列を調べることで、結合している転写因子を同定することが可能であり、協調して白血病化に寄与していると考えられる遺伝子群の抽出を試みた。その結果、予後不良であるPRDM16遺伝子高発現症例ではPRDM16遺伝子のpromotor領域ではなく、遺伝子bodyがpartialにオープンとなっていることを同定し、さらに遺伝子後半部に座位するストロングエンハンサー領域がオープンとなっていること、またモチーフ解析の結果、4つの転写因子を候補として同定した。さらに、予後不良AMLでは細胞増殖シグナルに関わるgene Xプロモーター領域がオープンとなっており、gene Xの発現が上昇、シグナルが活性化されていると考えられた。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
3: Progress in research has been slightly delayed.
Reason
microRNAを施行するために用意した小児AML検体のqualityが悪く、十分な量のmicroRNAの確保が困難であった。今年度、すでに別の新たなRNAを48サンプル確保出来たため、より簡便で少ない量のRNAで網羅的にmicroRNAの発現を調べることが可能なnCounterを用いて解析を行う予定である。また、ATAC-seqで得られた結果から、オープンクロマチン領域自体、ならびに結合していると考えられる候補転写因子に対する抗体を利用して、CHIP-seqを行う予定であるが、使用する抗体のqualityを吟味してから行いたいと考えており、もっとも効率的に解析可能な抗体を選別するのに時間を要している。しかしながら、抗体の目途は立っており、今年度中にChip-seqを行う予定である。
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| Strategy for Future Research Activity |
今後、ATAC-seqで得られた結果から、オープンクロマチン領域自体、もしくは結合していると考えられる4つの候補転写因子のAMLの関わりについて検討を行う。具体的には、PRDM16に対する抗体を利用し、CHIP-seqを行うことで、これらの遺伝子の関与が明らかにできものと考えている。また、これまでに我々の実施した網羅的メチル化アレイの結果、PRDM16遺伝子高発現症例ではPRDM16遺伝子は部分的に高度にメチル化され、ポリコームとの結合が障害されることも同定しており、その結果、ポリコーム抑制機能が解除され、HOX pathwayの活性化に繋がったと考えられる。この点についてはバイサルファイトシーケンス等を用いることで、結合部位のメチル化の程度を評価することで、このメカニズムを明らかにできるものと考えている。そして、gene X高発現株（THP-1など）を用いて、gene Xに対する阻害剤への効果を検討したいと考えている。
また、AMLは様々な遺伝子背景をもつヘテロな疾患であり、24～48例程度のサンプルを選別してミニモデルを作成し、nCounterを用いてmicroRNAシーケンスを施行する。その結果を遺伝子異常や遺伝子発現データと照合することで、予後良好例、不良例の差異を見出すと同時に白血病進展に関連するパスウェイの同定を試みる。
最終的には、PRDM16の近傍に存在する遺伝子をCHIP法で抽出した後、CHIP-seqを行い、DNAとタンパク質の結合部位を明らかにするとともに、プロテオーム解析を行い、周辺にリクルートされているタンパク質の同定を試みる。特に、PRDM16、ポリコームタンパク群（EZH2等）、HOX pathwayが難治性白血病の重要なターゲットになると考えられることから、これらの活性を阻害する標的を同定することは新規薬剤の開発につながることが期待される。
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[Journal Article] Transcriptome analysis offers a comprehensive illustration of the genetic background of pediatric acute myeloid leukemia2019
Author(s)
Shiba N, Yoshida K, Hara Y, Yamato G, Shiraishi Y, Matsuo H, Okuno Y, Kaburagi T, Takeuchi M, Ohki K, Sanada M, Okubo J, Tomizawa D, Taki T, Shimada A, Horibe K, Taga T, Adachi S, Tawa A, Miyano S, Ogawa S, Hayashi Y, et.al.
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Journal Title
Blood Advances
Volume: 3
Pages: 3157～3169
DOI
Peer Reviewed / Open Access
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[Journal Article] Comparison of conditioning regimens for autologous stem cell transplantation in children with acute myeloid leukemia: A nationwide retrospective study in Japan2019
Author(s)
Sakaguchi H, Muramatsu H, Hasegawa D, Kudo K, Ishida H, Yoshida N, Koh K, Noguchi M, Shiba N, Tokimasa S, Fukuda T, Goto H, Miyamura T, Nakazawa Y, Hashii Y, Inoue M, Atsuta Y
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Journal Title
Pediatric Blood & Cancer
Volume: 66
Pages: e27459～e27459
DOI
Peer Reviewed
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[Presentation] The Detection of Minor Clones with Somatic KIT D8 16V Mutations Using Droplet Digital PCR in Pediatric De Novo AML: AML-05 Trial from the Japanese Pediatric Leukemia/ Lymphoma Study Group.2019
Author(s)
Sasaki K, Uchiyama Y, Ikeda J, Yoshitomi M, Shimosato-Wada Y, Tokumasu M, Matsuo H, Yoshida K, Oki K, Yamato G, Hara Y, Kinoshita A, Tomizawa D, Taga T, Adachi S, Tawa A, Horibe K, Matsumoto N, Ito S, Hayashi Y, Shiba N
Organizer
61st American Society of Hematology Annual Meeting
Int'l Joint Research
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[Presentation] Recurrent Gene Mutations in Peadiatric Patients with AML By Targeted Sequencing -the Jccg Study, JPLSG AML-05-.2019
Author(s)
Kaburagi T, Yamato G, Shiba N, Yoshida K, Hara Y, Shiraishi Y, Ohki K, Sotomatsu M, Arakawa H, Matsuo H, Shimada A, Taki T, Kiyokawa N, Tomizawa D, Horibe K, Miyano S, Taga T, Adachi S, Ogawa S, Hayashi Y
Organizer
61st American Society of Hematology Annual Meeting
Int'l Joint Research
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[Presentation] Clinical Features of Pediatric Acute Myeloid Leukemia with TP53 and CDKN2A/2B copy Number Alterations.2019
Author(s)
Hara Y, Taki T, Yamato G, Yoshida K, Shiozawa Y, Shiba N, Kaburagi T, Shiraishi Y, Ohki K, Kawamura M, Sotomatsu M, Arakawa H, Matsuo H, Shimada A, Toki T, Kiyokawa N, Tomizawa D, Tago T, Ito E, Horibe K, Miyano S, Ogawa S, Adachi S, Hayashi Y
Organizer
61st American Society of Hematology Annual Meeting
Int'l Joint Research
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[Presentation] Significant Feature of DNA Methylation at Bivalent Promotor and Repressed Polycomb Regions in Padiatric AML-the Jccg Study, JPLSG AML-05-.2019
Author(s)
Yamato G, Kawai T, Shiba N, Hara Y, Ohki K, Kaburagi T, Yoshida K, Shiraishi Y, Miyano S, Kiyokawa N, Tomizawa D, Shimada A, Sotomatsu M, Arakawa H, Adachi S, Tago T, Horibe K, Ogawa S, Hata K, Hayashi Y
Organizer
61st American Society of Hematology Annual Meeting
Int'l Joint Research
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[Presentation] Recurrent gene mutations in pediatric AML by targeted sequencing using a 343-gene custom panel.2019
Author(s)
Kaburagi T, Yamato G, Shiba N, Yoshida K, Hara Y, Shiraishi Y, Ohki K, Sotomatsu M, Arakawa H, Matsuo H, Shimada A, Taki T, Kiyokawa N, Tomizawa D, Horibe K, Miyano S, Adachi S, Taga T, Ogawa S, Hayashi Y
Organizer
81st Annual Meeting of the Japanese Society of Hematology
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[Presentation] Comprehensive methylation analysis in pediatric AML patients -the JCCG, JPLSG AML-05 study-.2019
Author(s)
Yamato G, Kawai T, Shiba N, Hara Y, Ohki K，Kaburagi T, Yoshida K，Shiraishi Y, Miyano S, Kiyokawa N, Tomizawa D, Shimada A, Sotomatsu M, Arakawa H, Adachi S, Taga T，Horibe K, Ogawa S, Hata K, Hayashi Y
Organizer
81st Annual Meeting of the Japanese Society of Hematology
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