The genetic role of Nodal and Tbx20 in congenital heart and lung defects

2019 Fiscal Year Research-status Report

• Project/Area Number: 19K08352
• Research Institution: Keio University
• Principal Investigator: 前田 潤 慶應義塾大学, 医学部(信濃町), 講師(非常勤) (00255506)
• Co-Investigator(Kenkyū-buntansha): 内田 敬子 慶應義塾大学, 保健管理センター(日吉), 准教授 (50286522)
• Project Period (FY): 2019-04-01 – 2022-03-31
• Keywords: Nodal / Tbx20 / IP3R2 / 内臓錯位症候群

Outline of Annual Research Achievements

複雑型先天性心疾患を発症した家系について、私たちは網羅的遺伝子解析を行い、心臓発生に必須のシグナル伝達分子、転写因子をコードするNODAL、TBX20のバリアントを同定した。複雑型先天性心疾患を高率に合併する内臓錯位症候群の分子機構の解明を目的に、令和元年度に以下の研究を行った。
NodalおよびTbx20遺伝子改変マウスの交配により、Nodal/Tbx20ダブルヘテロ接合性ノックアウトマウスを作製し、心大血管表現型について解析した。まず、Nodalヘテロ接合性ノックアウトマウス、Tbx20ヘテロ接合性ノックアウトマウス成獣について、心大血管および内臓位に異常がなく、妊孕性があることを確認した。Nodal/Tbx20ダブルヘテロ接合性ノックアウトマウス幼獣の出生頻度は野生型幼獣の出生頻度と比較して有意に低いことが判明し、胎内死亡している可能性が示唆された。現在、Nodal/Tbx20ダブルヘテロ接合性ノックアウトマウス胎仔を胎生中期以降に採取し、心大血管表現型の解析を行っている。また、Tbx20ヘテロ接合性ノックアウトマウスと肺血管内皮細胞を標識できるIP3R2-lacZレポーターマウスとの交配を行い、Tbx20/IP3R2-lacZヘテロ接合性マウスを得た後に、さらにNodalヘテロ接合性ノックアウトマウスと交配することで、ダブルヘテロ接合性ノックアウトマウスにおける肺血管形態を可視化することを試みている。
その他、患者家系で同定されたNodal遺伝子変異をもつ蛋白を合成、培養細胞に導入し、下流シグナル（Smad2およびSmad3のリン酸化）の増減を、野生型Nodal蛋白を導入した場合と比較して解析中である。同じく患者家系で同定されたTbx20遺伝子変異については、ANFルシフェラーゼレポーターを用いた解析を行い、変異型Tbx20が機能喪失型であることが判明した。

Current Status of Research Progress

4: Progress in research has been delayed.

Reason

理論上、Nodal/Tbx20ダブルヘテロ接合性ノックアウトマウスは、幼獣の全出生数の25%を占めるはずであるが、実際の出生数、胎仔数は少ない。早期に胎内死亡している可能性があるが、胎生期早期の解析が不十分である。また、出生したダブルヘテロ接合性ノックアウトマウスは外観上正常で、Nodal/Tbx20のダブルヘテロ接合性遺伝子変異を有していても、胎内環境によっては心臓血管発生に影響がない、すなわち胎仔により浸透度が異なる可能性が考えられる。

Strategy for Future Research Activity

Nodalヘテロ接合性ノックアウトマウスとTbx20ヘテロ接合性ノックアウトマウスの交配を行い、胎生前期、中期、晩期において胎仔の表現型解析を行う。また、Tbx20ヘテロ接合性ノックアウトマウスとIP3R2-lacZレポーターマウスとの交配をすすめ、さらにNodalヘテロ接合性ノックアウトマウスと交配させることによって、ダブルヘテロ接合性ノックアウトマウスの肺血管をβ-gal色素で標識して、肺血管形態を観察する。