2019 Fiscal Year Research-status Report
Application of a new biomarker LRG to real-world clinical practice of inflammatory bowel disease
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19K08371
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| Research Institution | Kochi University |
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Principal Investigator |
藤本 穣 高知大学, 教育研究部医療学系臨床医学部門, 准教授 (00379190)
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| Project Period (FY) |
2019-04-01 – 2022-03-31
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| Keywords | マーカー / サイトカイン / LRG |
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| Outline of Annual Research Achievements |
既存の炎症マーカーCRPの発現誘導はサイトカインIL-6と肝細胞に依存しており、CRPは一部の免疫疾患の病勢を捉えることができない。研究代表者らのシーズであるマーカーLRGは、炎症性腸疾患（IBD）の活動性評価においてCRPより感度が良好で、内視鏡による評価との相関性も高い。この結果LRGは、IBD初の血清活動性バイオマーカーとして2018年に製造販売承認を取得した。しかし、CRPでは評価しがたいIBDの活動性をLRGがなぜ反映できるのか、その詳細はいまだ不明である。これまでの検討では、LRGの発現誘導に複数のサイトカインが関与し、肝細胞以外にも多くの細胞がLRG産生能を有することが示唆される。そこで本研究では、IBD関連サイトカインに着目し、それらの刺激にLRG産生細胞がどう応答するかを調べてLRGの発現制御機構を解明し、IBD病態とLRGの関係をより明確にすることを目指す。
IBDモデルマウス（DSS腸炎）の大腸を免疫組織化学染色で評価すると、炎症部位の腸上皮細胞および浸潤する免疫系細胞において強いLRG発現を認めた。そこでin vitroにおいて、いくつかの細胞株（肝細胞系細胞株、腸上皮系細胞株、単球系細胞株、骨髄球系細胞株）のLRG産生をチェックして、サイトカイン等の刺激前後のLRG産生をWestern Blot、ELISA、Real-time PCRにて調べた。その結果、細胞の種類によってLRG産生を特に増強するサイトカインの種類が異なることが明らかになった。並行して各細胞へのトランスフェクション手法を確立し、プロモーターのルシフェラーゼアッセイやsiRNAを用いた検証も進めている。
ヒトIBDを対象とする臨床研究においては新たに臨床研究プロトコールを作成し、年度内に研究承認を得ることができた。本年から検体の収集を開始したところである。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
初年度では、IBDの病態においてLRG産生に関わる細胞のモデルとして、肝細胞系細胞株、腸上皮系細胞株、単球系細胞株、骨髄球系細胞株の各種細胞株を用意し、計画に従ってサイトカイン等の刺激を行いLRG発現の比較定量を実施した。LRG産生については、IL-6やIL-22などに反応性が良く、おそらく転写因子STAT3への依存性が強い細胞株と、IL-1βやTNF-αなどによく応答して転写因子NFkBへの依存性が強い細胞株の存在が明らかになってきた。この点はさらに、LRGプロモーター解析（ルシフェラーゼアッセイ）や転写因子のsiRNAノックダウン実験を用いて検証していく予定で、すでに実験をスタートさせている。
上記の結果については、可能な限りヒトIBDの臨床検体を用いた研究で検証していく計画である。未治療な状態、つまり高活動性であって治療薬で修飾されていない状況のIBDを評価することが望ましい。そこで、新規の患者から治療開始前後の血清を収集し、さらに内視鏡実施例については腸粘膜病変部位を提供していただき解析できるよう、研究計画をあらたに策定した。初年度のうちに本学および協力施設での申請および承認を済ませ、対象者のリクルートを開始しており、進捗は概ね事前の計画通りである。
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| Strategy for Future Research Activity |
2020年度以降では、LRGを発現する細胞株を利用し、デュアルルシフェラーゼアッセイによりLRGプロモーターの制御機構の解明を行う。すでに構築済みの変異LRGプロモーターを併用して、STATおよびNFkBの結合予測配列の重要性を明らかにする。また、siRNAを用いてSTATやNFkB等の転写因子のノックダウンを行い、LRG発現誘導実験およびプロモーターアッセイの結果の検証を行う。研究の進展状況に応じ、IBDマウスモデルであるDSS腸炎を用いて、in vivoでの検証を行いたい。また患者血清サンプルにおいて、重要と考えられるサイトカインの濃度を測定し、LRG定量値と比較する。患者由来の生検検体については、遺伝子発現解析のために順次mRNAを抽出してストックしておく。サイトカインやLRGの関連性を、血液および腸粘膜で見出すことが目標である。
文献的には、病変部位におけるOncostatin M（OSM）の発現が、IBDの病態、特に抗TNF治療抵抗性の難治性病態に関与すると報告されている。最近、IBDの治療薬として、IL-12/23阻害薬やJAK阻害薬などのサイトカイン系阻害薬、α4β7インテグリン阻害薬のような免疫細胞遊走阻害薬など、新しい製剤が次々と実用化されている。IBDの病変部位におけるサイトカイン環境や免疫細胞の集積状態をLRGがどう反映するのかを理解することができれば、重症度判定や治療予測等、実臨床での新たなLRG活用法を見出すことができると期待している。
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| Causes of Carryover |
２０１９年度にヒト臨床検体の処理と解析をスタートする際に、必要な試薬を購入する計画であったが、収集した検体数がまだ少ないことから、次年度分に回して購入・実施する計画に変更した。このため未使用額が生じたが、次年度の検体解析を実施する際に、試薬を購入するための経費にあてたい。
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