免疫チェックポイント・タンパク質PD-L1を分子標的とした新規免疫治療法の開発

2019 Fiscal Year Research-status Report

• Project/Area Number: 19K08399
• Research Institution: Nagoya City University
• Principal Investigator: 谷田 諭史 名古屋市立大学, 医薬学総合研究院(医学), 准教授 (30528782)
• Co-Investigator(Kenkyū-buntansha): 前川 大志 愛媛大学, プロテオサイエンスセンター, 助教 (10771917)
• Project Period (FY): 2019-04-01 – 2022-03-31
• Keywords: PD-L1細胞内移行システム / Cullin3 / ANKFY1

Outline of Annual Research Achievements

1. PD-L1の細胞内膜輸送を制御するCUL3-ANKFY1の基質探索
CUL3-ANKFY1の基質の同定は、本申請課題の最重要課題である。各種培養消化器がん細胞株において、アスコルビン酸ペルオキシダーゼ変異体(Ascorbate Peroxidase 2, APEX2) (Nature Methods 2015)を用いた生細胞でのin vivoビオチン標識法を行い。CUL3-ANKFY1の基質は、Rab5が候補の一つだということを同定した。
2.CUL3-ANKFY1の基質欠失時のPD-L1の細胞内膜輸送阻害効果の検証
PD-L1蛋白質輸送システムのイメ-ジング解析および細胞フラクションウェスタン解析によるPD-L1蛋白局在の確認
各種細胞株にANKFY1 siRNAオリゴまたは、コントロールオリゴ(Thermo Fisher Scientific)をトランスフェクション施し、ANKFY1欠失させたあと、95%エタノール、30分間固定し、そのあとアセトン(-20℃)1分常温でインキュベーションしたあと、蛍光標識したPD-L1抗体(abcam) 4℃で処置した後、37℃で細胞膜から細胞内への輸送系をConfocal microscopeにて観察した。また、細胞膜、細胞質、細胞核のフラクションでのPD-L1の局在発現も確認した。ANKFY1欠失により、ウェスタン解析および免疫染色により、PD-L１は、局在は、細胞質に局在することが明らかになった。つまり、ANKFY1欠失によりPD-L1の細胞膜への移動が阻害された。また、Rab5の欠失によっても、ウェスタン解析および免疫染色により、PD-L１は、局在は、細胞質に留まることが明らかになった。Rab5欠失によっても、PD-L1の細胞膜への移動が阻害されたことが明らかになった。

Current Status of Research Progress

2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.

Reason

1. PD-L1の細胞内膜輸送を制御するCUL3-ANKFY1の基質探索をし、基質がRab5であることを突き止めることができ、ANKFY1,Rab５欠失により、PD-L1の細胞膜への移行が阻害されたことが明らかにすることができた。

Strategy for Future Research Activity

1.ANKFY1欠失時のRab5の細胞免疫染色および細胞膜、細胞質、細胞核のフラクションウェスタン解析。2.Rab5欠失時のANKFY1細胞免疫染色および細胞膜、細胞質、細胞核のフラクションウェスタン解析。3.ANKFY1欠失時のRab5およびPD-L1の細胞免疫共染色。4.Rab5欠失時のANKFY1およびPD-L1の細胞免疫共染色。5.Cullin３、ANKFY1,Rab5欠失時のビオチンラベルによる細胞膜上のPD-L1局在の評価。6.タンパク質間相互作用検出システムAlphascreen systemを用い、ANKFY1-Rab5基質結合阻害薬の探索。
上記の解析、研究を続けていく。

Causes of Carryover

（理由）
ANKFY1に結合する基質は、Rab5であることを突き止めた。次に実施するANKFY1-Rab5基質結合阻害薬の探索を次年度以降に行うこととしたため。
（使用計画）
タンパク質間相互作用検出システムAlphascreen systemを用い、1万化合物ライブラリーからスクリーニングを行い、低濃度で強い結合阻害活性を持つ化合物を探索する。